分子生物學與慢性粒細胞白血病

分子生物學與慢性粒細胞白血病一、概述慢性粒細胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)簡稱慢粒。概念：是一種發(fā)生在早期多能造血干細胞上的惡性骨髓增殖性疾?。ǐ@得性造血干細胞惡性克隆性疾病)。Chronicmyelogenousleukemia,chronicphase.2021/4/272病因：CML的病因比較復雜，較為公認的致病因素是電離輻射，如X射線、γ射線等。暴露于輻射的人群有較高的CML發(fā)病率。日本廣島及長崎原子彈輻射后，慢粒的發(fā)病率較未照射人群高17倍。主要特點：本病病程發(fā)展緩慢，外周血粒細胞顯著增多且不成熟，脾臟明顯腫大。自然病程可經歷慢性期、加速期和急變期，多因急性變而死亡。本病各年齡組均可發(fā)病，以中年最多見。2021/4/273二、CML分子生物學發(fā)病機理Ph染色體與融合基因

90%以上的慢粒患者中可發(fā)現(xiàn)有Ph染色體，即t(9；22)(q34；q11)，9號染色體q34上的原癌基因c-ABL的片段易位至22號染色體q11上的斷裂點簇集區(qū)（breakpointclusterregion，BCR），產生BCR-ABL融合基因。這也是人類在白血病染色體易位中發(fā)現(xiàn)的第一個融合基因。2021/4/274CytogeneticAbnormalityofCML:

ThePhChromosome9222021/4/2752021/4/276

Bcr/abl融合基因的結構2021/4/277Bcr/abl融合蛋白與白血病1.p210BCR-ABL,見于絕大部分CML及50%以上成人Ph染色體陽性的ALL。2.p190BCR-ABL,常見于50%Ph染色體陽性的成人ALL和80%Ph染色體陽性的兒童ALL。3.p230BCR-ABL,whichisassociatedwithrarecasesofPh-positiveCML.2021/4/278Bcr-abl融合基因致病的分子機制Bcr/abl融合基因的編碼產物p210、p230等融合蛋白具有很強的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活結構性酪氨酸激酶（tyrosinekinase,TK）。而酪氨酸激酶是一種催化ATPγ-磷酸酶轉移到蛋白質酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，進而激活細胞中多種信號轉到途徑，促進細胞增殖，減少細胞凋亡，最終導致慢性粒細胞白血病的發(fā)生。2021/4/279三、BCR-ABL融合基因的分子生物學檢測技術1.RT-PCR：是以mRNA為模板反轉錄出cDNA，再以cDNA為模板進行PCR，是在RNA水平上檢測BCR-ABL融合基因。該方法靈敏度高，可用于MRD的檢測，但反轉錄-PCR是一種定性實驗，不能對白血病患者的BCR-ABL融合基因給出定量分析，也可能會因RNA降解而出現(xiàn)假陰性。2021/4/27102.實時定量熒光-PCR：是以熒光共振能量轉移原理為基礎，在PCR擴增的同時，加入引物的同時加入特異性的熒光探針;是通過實驗檢測過程中的熒光強度變化對PCR擴增產物進行的一種定量檢測方法。實時定量熒光PCR由于其具靈敏度高(10－5～10－6)、可準確定量觀察、迅速、重復性好等優(yōu)點，在MRD檢測中具有非常重要的優(yōu)勢。2021/4/27113.CBA法：是指用已知大小及性質的磁珠與一組可溶的蛋白分析物結合，以檢測人類血液樣本的BCR-ABL融合蛋白。其檢測試劑為一種結合藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)的單克隆抗體，可對BCR-ABL蛋白的ABL特異性結合，當免疫磁珠與BCR-ABL融合蛋白共混時，則可形成三明治狀的復合物，蛋白的BCR端為結合了抗體的微球，ABL端為結合了藻紅蛋白的抗體?；诳贵w的大小及性質，可使用流式細胞儀對該種復合物進行研究，從而檢測出BCR-ABL融合蛋白。2021/4/2712BCR-ABL融合基因可翻譯產生融合蛋白可以被抗BCR的捕獲磁珠及連接PE的抗ABL抗體結合。在流式細胞儀上對捕獲磁珠的檢測，可檢測出PE的熒光信號。2021/4/27134.FISH法：是利用標記的DNA或RNA探針直接在染色體、細胞或組織水平定位特定靶核酸序列的分子細胞遺傳學技術，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量。主要應用于染色體易位形成的融合基因檢測、基因缺失的檢測及MRD檢測等。具有快速、安全、經濟、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。對白血病臨床療效的判定及預測預后也具有重要意義。2021/4/27145.Southern印跡(SouthernBlot)法可對bcr-abl融合基因DNA重排進行分子生物學檢測。將待測基因組DNA片段經電泳分離后轉移到固相雜交膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探針與之雜交，經放射自顯影洗片后即可顯示所要檢測的條帶，對于CML患者，除可見到一條與胚系bcr基因組DNA相對應的條帶外，其他的條帶說明存在重排的bcr等位基因。2021/4/2715Southen印記法實驗流程圖2021/4/2716四、分子靶向治療（moleculartargetingtreatment）信號傳導抑制劑

(SignalTransductionInhibitor,STI)2021/4/2717分子靶向藥物——酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（imatinibmesylate），商品名為格列衛(wèi)，為治療CML的常用分子靶向藥物。屬小分子化合物，是一種特異性很強的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）。對體內眾多酪氨酸激酶，它僅能抑制BCR-ABL融合基因產物P210和P190、PDGFR（血小板衍化生長因子）與c-Kit受體的酪氨酸激酶。2021/4/2718格列衛(wèi)藥理作用的分子機制格列衛(wèi)通過特異性地與BCR/ABL激酶結構域的ATP位點結合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸殘基不能磷酸化，從而抑制其細胞信號傳導途徑,促使細胞凋亡和抑制Ph陽性白血病細胞的增殖。格列衛(wèi)是CML治療史上的里程牌,并且對CML具有很好的療效，可使患者達到遺傳學或分子生物學緩解。2021/4/2719Mechanismofactionofimatinib.ByoccupyingtheATPbindingpocketoftheABLkinasedomain,imatinibpreventssubstratephosphorylationanddownstreamactivationofsignals,