降鈣素基因相關肽與運動性疲勞的潛在關系,運動生物化學論文

降鈣素基因相關肽與運動性疲勞的潛在關系,運動生物化學論文原標題：降鈣素基因相關肽對大鼠運動性疲憊的影響內容摘要：目的：討論降鈣素基因相關肽〔CGRP〕對大鼠運動性疲憊的影響。方式方法：成年健康雄性SD大鼠，根據不同的預處理措施隨機分成5組：空白對照組、磷酸鹽緩沖液〔PBS〕預處理組、CGRP預處理組、辣椒素〔CAP〕預處理組、CAP預處理+CGRP預處理組，各組動物在平靜狀態(tài)時、運動80min時和運動至力竭后即刻處死。然后用免疫組化和放射免疫方式方法檢測上述條件下大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表示出變化；用蘇木精-伊紅〔HE〕染色觀察上述條件下運動性疲憊大鼠骨骼肌形態(tài)構造的變化；用化學比色的方式方法檢測上述條件下骨骼肌超氧化物歧化酶〔SOD〕、谷胱甘肽過氧化物酶〔GSH-PX〕、過氧化氫酶〔CAT〕及丙二醛〔MDA〕的變化。結果：1〕給予CGRP預處理后，大鼠運動至力竭的時間明顯縮短〔P0.05〕，而給予CAP預處理后大鼠運動至力竭的時間明顯延長〔P0.05〕；2〕CGRP免疫組織化學和放射免疫結果顯示，CGRP的免疫陽性產物在肌纖維縱切面上，其形狀為橢圓形或棒狀，主要分布于肌纖維膜的外表。給予CGRP預處理后，大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表示出明顯升高〔P0.05〕，而給予CAP預處理后，大鼠腓腸肌神經肌肉接頭CGRP的表示出明顯下降〔P0.05〕；3〕HE染色顯示，平靜狀態(tài)下各組骨骼肌的形態(tài)構造未見明顯改變；與平靜狀態(tài)相比，運動80min時除CGRP預處理組骨骼肌的細胞核明顯增加、增大外，其余各組均無明顯改變；力竭運動后即刻與平靜狀態(tài)下相比，除CAP預處理組無明顯改變外，其余各組骨骼肌的細胞核均明顯增加、增大；4〕化學比色結果顯示，給予CGRP預處理后，大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX和CAT的活性明顯下降〔P0.05〕，MDA的含量明顯上升〔P0.05〕，而給予CAP預處理后大鼠骨骼肌中SOD、GSH-PX和CAT的活性明顯上升〔P0.05〕，MDA的含量明顯下降〔P0.05〕。結論：CGRP加劇了運動性疲憊的產生。本文關鍵詞語：降鈣素基因相關肽；運動性疲憊；骨骼??；自由基運動性疲憊是機體對運動訓練刺激所產生的一系列綜合性復雜反響，易導致骨骼肌系統(tǒng)損傷，神經內分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等功能障礙，機體的運動能力下降[7,19,28,32].運動性疲憊的產生不僅與中樞神經系統(tǒng)沒有足夠的運動神經元驅動有關，而且與神經肌肉接頭傳遞的失敗及周圍肌肉代謝水平的改變有關。因而，神經肌肉接頭是運動性疲憊在外周產生的一個重要位點。當前，有關運動性疲憊與神經肌肉接頭的研究主要集中于突觸前和突觸后[27,31].在突觸前其可能存在的機制有：Ca2+內流的下降；Ca2+對神經末梢囊泡釋放敏感性的下降；可利用的囊泡數(shù)量下降。在突觸后其可能存在的機制有：乙酰膽堿受體〔AChR〕的脫敏；肌纖維膜興奮性的下降。自從在腦、脊髓運動神經元和運動神經末梢檢測出降鈣素基因相關肽〔calcitoningene-relatedpeptide,CGRP〕后，CGRP在神經肌肉接頭作為一種神經調質和/或營養(yǎng)補劑就被廣泛研究[5,10,20,25].CGRP被輸送到神經肌肉接頭的神經末梢后儲存在致密核心小泡〔LDCV〕[6,15],以Ca2+依靠方式伴隨神經刺激而釋放[10,22,30],進而影響肌肉的代謝、構造和功能特征。因而，CGRP的變化將導致該神經所支配骨骼肌的代謝、構造和功能特征的改變[24].研究表示清楚，CGRP有雙重效應,正常生理條件下CGRP的釋放對靶組織起營養(yǎng)作用，能夠擴張周圍血管，促進AChR的合成，并對睪丸下降、胃腸活動、胃酸分泌等有良好的成效，并能抑制活性氧自由基的產生和緩減組織的氧化應激，對組織起內源性的保衛(wèi)作用，然而，在應激或病理條件下，CGRP也能直接或間接的導致脊髓、骨骼肌興奮性的改變和炎癥的發(fā)生，對組織造成損傷[12,17].有關CGRP與運動性疲憊的關系，Homonko等和Theriault〔1997〕等的研究表示清楚，一次性大強度的運動可導致大鼠后肢運動神經元CGRP顯著提高[13];另有研究表示清楚，在運動經過中骨骼肌CGRP的改變與運動和/或骨骼肌的缺血缺氧有關[4],這提示，CGRP可能與運動性疲憊的產生有關，但CGRP在運動性疲憊大鼠神經肌肉接頭的生理和生物學角色當前仍不清楚。本研究通過一次性運動至力竭疲憊動物模型，運用免疫組化、放射免疫、蘇木精-伊紅〔hematoxylin-eosin,HE〕染色和化學比色的方式方法并結合補充外源性的CGRP和皮下注射CGRP耗竭劑的方式方法檢測CGRP對大鼠運動至力竭時間、骨骼肌的形態(tài)構造、酶的活性和自由基代謝的影響，探尋求索CGRP與運動性疲憊之間的潛在關系。1材料和方式方法1.1實驗動物與主要試劑成年健康雄性SD大鼠150只，體重200~250g,購自湖南農業(yè)大學動物科學學院，所有動物經一般體查均無異常。所有大鼠都置于同一動物房，分籠飼養(yǎng)，室溫16~22℃，相對濕度45%~55%,正常晝夜節(jié)律，自由飲食。CGRP、辣椒素和多克隆兔抗CGRP抗體均購于Sigma公司，骨骼肌超氧化物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕、谷胱甘肽過氧化物酶〔glutathioneperoxidase,GSH-PX〕、過氧化氫酶〔catalase,CAT〕及丙二醛〔malondialdehyde,MDA〕均購于南京建成生物工程研究所，CGRP放射免疫試劑盒購于北京東亞放免技術研究所。1.2動物模型制備動物模型的制備根據Bedford[3]所建立的疲憊運動模型，采用一次性大強度電動跑臺運動至力竭的方式，即水平跑速為28m/min〔超過90%VO2max〕，運動至力竭。力竭判定標準為連續(xù)給予大鼠機械刺激后，大鼠不能繼續(xù)跑動，下跑臺后伏地喘息，暫時無逃避反響。在進行正式實驗前，大鼠天天進行一次適應性低強度〔跑臺坡度為0，速度10m/min,持續(xù)時間為10min〕跑臺訓練，共訓練3天，然后進行一次預備的力竭性運動訓練，根據動物運動至力竭的時間剔除運動能力太差和運動能力太強的大鼠后隨機分組，休息10天后進行正式實驗。1.3實驗動物分組將150只大鼠根據不同的預處理措施隨機分成5組：空白對照組、PBS預處理組、CGRP預處理組、CAP預處理組、CAP預處理+CGRP預處理組，各組大鼠在平靜狀態(tài)時、運動80min時和運動至力竭后即刻處死。1.4PBS、CGRP和CAP的預處理大鼠皮下注射PBS、CAP、純化的大鼠CGRP.PBS預處理組、CGRP預處理組和CAP預處理組于力竭運動前4天兩次皮下給予PBS〔每次300l〕、CGRP〔每次120g,300lPBS溶解，Sigma〕和CAP〔每次50mg/kg,溶于10%無水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中〕。CAP預處理+CGRP預處理組于力竭運動前8天的前1~4天兩次皮下給予CAP〔每次50mg/kg,溶于10%無水酒精+10%吐溫-80+80%生理鹽水中〕，后5~8天兩次皮下給予CGRP〔每次120g,300lPBS溶解，Sigma〕。1.5組織制備各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛〔4ml/kg〕，待麻醉后快速取左側腓腸肌內側頭，除去外表的凝血及結締組織，經冰冷生理鹽水洗滌幾次，用濾紙吸干水分，用做放射免疫分析的標本放入1ml0.1M冰醋酸在手動勻漿管中冰浴勻漿研磨，用做酶活性和自由基檢測的標本按1g組織中參加10mL冰鹽水的比例作為勻漿介質在手動勻漿管中稀釋，并勻漿研磨，再經4℃3000r/min離心10min,取上清液儲存于-20℃冰箱保存待測。用作免疫組織化學染色和HE染色的組織，在上述大鼠麻醉快速取下左側腓腸肌內側頭后，開胸經左心室插管入升主動脈，先灌以生理鹽水〔150ml〕，繼之以4%多聚甲醛磷酸緩沖液〔500ml,pH7.4,4℃〕灌注固定，先快后慢。取右側腓腸肌內側頭，剔除筋膜，入一樣的灌注液4℃后固定過夜，0.01MPBS充分洗滌后，OCT包埋于-80℃保存?zhèn)溆谩?.6CGRP免疫組織化學染色標本于-80℃冰箱取出后，-20℃三頓恒低溫切片機切片，片厚200m,進行CGRP免疫組織化學染色，采用漂浮法，主要經過如下：1〕切片用0.01MPBS〔pH7.4〕振動漂洗3次，每次10min;2〕入含0.3%的甲醇雙氧水，20min;3〕0.01MPBS〔pH7.4〕振動漂洗3次，每次10min;4〕入5%正常小牛血清白蛋白〔BSA〕室溫封閉2h;5〕入1∶1000的多克隆兔抗CGRP抗體〔Sigma〕4℃孵育過3夜；6〕0.01MPBS〔pH7.4〕振動漂洗3次，每次10min;7〕入1∶200生物素化山羊抗兔IgG〔Vector〕37℃孵育2h;8〕0.01MPBS〔pH7.4〕振動漂洗3次，每次10min;9〕入1∶200ABC復合物〔Vector,預先30min配制〕，37℃2h;10〕入0.05%DAB+0.03%雙氧水顯色，0.01MPBS終止反響、貼片、常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照采用正常小牛血清代替一抗，其余步驟與上述一樣，結果為陰性。1.7骨骼肌CGRP濃度的測定測定時用0.1M的PBS5倍稀釋。按要求依次加樣后，充分混勻，室溫放置20min后，4℃3000rpm離心25min,取上清液，在計數(shù)器上測定CPM數(shù)。通過預先編制的程序，直接給出CGRP濃度。1.8HE染色標本于-80℃冰箱取出后，0.01MPBS充分洗滌后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚4m.HE染色按以下步驟進行：常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水后行HE染色。蘇木精液染色6min,流水沖洗，1%鹽酸處理3s,稍水洗，1%氨水返藍5s,流水沖洗，0.5%伊紅液染色3min,稍水洗，80%、90%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。1.9SOD、GSH-PX、CAT活性測定及MDA含量測定SOD、GSH-PX、CAT的活性及MDA的含量測定采用比色法，組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。詳細操作如下：1〕取樣品參加干凈試管中，依次參加各試劑，混勻，95℃或37℃水浴，參加中止液；2〕蒸餾水調零，測定吸光度OD值；3〕空白管用蒸餾水代替樣品，標準管用標準液代替樣品，其他步驟一樣；4〕根據樣品、空白管、標準管在分光光度計