光學顯微鏡基礎(chǔ)知識

光學顯微鏡基礎(chǔ)知識光學顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學原理象差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學部件基礎(chǔ)知識第二頁，共90頁。顯微鏡成像FF’物鏡第三頁，共90頁。顯微鏡成像FF’物鏡第四頁，共90頁。顯微鏡成像物鏡250mm＝明視距離FF’目鏡第五頁，共90頁?；A(chǔ)知識光學顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學原理像差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學部件第六頁，共90頁。理想成像點

標本投影圖像點平面平面圖形準確

相似

圖形像差第七頁，共90頁。實際圖形點

標本投影圖像虛的圓

平面彎曲的面圖形變形的圖形像差第八頁，共90頁。象差的種類球差象散慧差畸變場曲色差基礎(chǔ)知識第九頁，共90頁。象差球差象散慧差場曲負畸變正畸變基礎(chǔ)知識第十頁，共90頁。場曲基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識ACHPLANACH第十一頁，共90頁。場曲

ＡＣＨＰＬ第十二頁，共90頁。色差基礎(chǔ)知識色差校正對照第十三頁，共90頁。色差校對無校對

校對

第十四頁，共90頁?；A(chǔ)知識光學顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學原理像差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學部件第十五頁，共90頁。顯微鏡的技術(shù)參數(shù)數(shù)值孔徑分辨率工作距離焦深放大倍率同焦距同軸度基礎(chǔ)知識第十六頁，共90頁。數(shù)值孔徑()基礎(chǔ)知識第十七頁，共90頁。分辨率基礎(chǔ)知識ΔR=kλ/NAΛ：波長NA：數(shù)值孔徑K常數(shù):K光鏡；KFV第十八頁，共90頁。數(shù)值孔徑大分辨率高基礎(chǔ)知識第十九頁，共90頁。NA與焦深基礎(chǔ)知識第二十頁，共90頁。工作距離()基礎(chǔ)知識第二十一頁，共90頁。工作距離不需要蓋玻片

有蓋玻片第二十二頁，共90頁。同焦距（齊焦距離)基礎(chǔ)知識第二十三頁，共90頁。同軸度基礎(chǔ)知識比如10倍物鏡下的中心轉(zhuǎn)換到40倍是仍然幾乎是中心第二十四頁，共90頁?？吕照彰骱团R界照明基礎(chǔ)知識第二十五頁，共90頁。臨界照明

柯勒照明基礎(chǔ)知識第二十六頁，共90頁。厚標本和薄標本4-5um2um基礎(chǔ)知識第二十七頁，共90頁?；A(chǔ)知識光學顯微鏡基礎(chǔ)知識顯微鏡的光學原理像差顯微鏡的技術(shù)參數(shù)顯微鏡的光學部件第二十八頁，共90頁。顯微鏡的主要光學部件物鏡目鏡聚光鏡基礎(chǔ)知識第二十九頁，共90頁。物鏡基礎(chǔ)知識第三十頁，共90頁。物鏡的種類按色差和場曲校正程度分:消色差物鏡（Ach)平場消色差物鏡(PlanAch)平場半復消色差物鏡(Plan-FL或PLFL）平場復消色差物鏡（PlanApo)平場超級復消色差物鏡（PlanSApo)基礎(chǔ)知識第三十一頁，共90頁。VIS－

NIR范圍內(nèi)優(yōu)異的色差校正信噪UPLSAPO物鏡第三十二頁，共90頁。消色差Ach –藍

(486nm)和紅

(657nm)半復消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))復消色差Apo –437-657nm超級復消色差SuperApo –430-1000nm物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差ACH第三十三頁，共90頁。消色差Ach –藍

(486nm)和紅

(657nm)半復消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))復消色差Apo –437-657nm超級復消色差SuperApo –430-1000nm物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差ACHFL第三十四頁，共90頁。IRIR消色差Ach –藍

(486nm)和紅

(657nm)半復消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))復消色差Apo –437-657nm

超級復消色差SuperApo –430-1000nm物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差ACHFLApo第三十五頁，共90頁。消色差Ach –藍

(486nm)和紅

(657nm)；綠球差半復消色差Fluorite –蘭和紅

+(綠,紫色(437nm))；綠、蘭球差復消色差Apo –437-657nm，綠、蘭、深蘭球差超級復消色差 –430-1000nmSuperApo物鏡的色差校正軸向色差側(cè)向色差ACHFLSApoIRIRApo第三十六頁，共90頁。消色差物鏡基礎(chǔ)知識復消色差物鏡半復消色差物鏡第三十七頁，共90頁。傳統(tǒng)物鏡的符號基礎(chǔ)知識第三十八頁，共90頁。新物鏡的符號基礎(chǔ)知識第三十九頁，共90頁。其它物鏡基礎(chǔ)知識浮雕相稱物鏡無應(yīng)力偏光物鏡相稱物鏡超低倍物鏡第四十頁，共90頁。帶校正環(huán)物鏡基礎(chǔ)知識第四十一頁，共90頁。對載波片和蓋玻片厚度的要求基礎(chǔ)知識載玻片:0.9-1.4mm蓋玻片:0.17mm第四十二頁，共90頁。無蓋片物鏡基礎(chǔ)知識第四十三頁，共90頁。物鏡光闌的運用光闌全開啟光闌適當關(guān)小——熒光觀察中應(yīng)用第四十四頁，共90頁。目鏡基礎(chǔ)知識第四十五頁，共90頁。目鏡的視場基礎(chǔ)知識F.N.22第四十六頁，共90頁。標本的視場直徑標本的視場直徑=目鏡視場數(shù)/物鏡倍率

例:WH10X目鏡視場數(shù)為22物鏡為UPLFL40X視場直徑基礎(chǔ)知識第四十七頁，共90頁。聚光鏡第四十八頁，共90頁。顯微鏡的調(diào)節(jié)瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)光路轉(zhuǎn)換聚光鏡中心孔徑光欄設(shè)置第四十九頁，共90頁。瞳距調(diào)節(jié)第五十頁，共90頁。屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)第五十一頁，共90頁。光路轉(zhuǎn)換100%80%20%100%第五十二頁，共90頁。聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場光闌③孔徑光闌②10X物鏡①標本④聚光鏡升降旋鈕第五十三頁，共90頁。孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物第五十四頁，共90頁?？讖焦鈾陂_度與圖象100%70%30%HRLCHCLRMRMC第五十五頁，共90頁?？讖焦鈾诘倪\用第五十六頁，共90頁。孔徑光欄的運用對比度調(diào)節(jié)第五十七頁，共90頁。奧林巴斯顯微鏡無限遠光學系統(tǒng)——UIS第五十八頁，共90頁。顯微鏡無限遠光學系統(tǒng)——UIS

有限遠無限遠UIS光學系統(tǒng)第五十九頁，共90頁。MeritoftheInfinitysystem

物鏡

D/M重影平行光線結(jié)像透鏡第六十頁，共90頁。第六十一頁，共90頁。UIS系統(tǒng)

Universal

Infinity

System————萬能無限遠系統(tǒng)1.完美結(jié)合分辨率和對比度

-明場高分辨率 -高對比度、高亮度圖像 -清晰的

DIC圖像 -更敏感的偏光觀察 -清晰、色彩明亮的相襯第六十二頁，共90頁。UIS系統(tǒng)Universal

Infinity

System2.系統(tǒng)靈活性 -無限遠校正光學系統(tǒng) -物鏡和結(jié)像透鏡完全校正3.物鏡萬能性更強 -AsingleuniversalobjectivelensperformsverywellinFluorescence,NomarskiDIC,Phasecontrast,Polarizedlightand,ofcourse,Brightfield -HighUVtransmission,Strain-free,PerfectcorrectionofChromaticaberrationandotheropticalaberrations

第六十三頁，共90頁。Competitioncomparison

F:FullyPrimaryCorrectioninobjective&tubelens

Tc:Tube-lensCompensation第六十四頁，共90頁。奧林巴斯顯微鏡無限遠光學系統(tǒng)——UIS增加附件，光路不變，倍率不變，F(xiàn).N.不變中間附件設(shè)計更簡單，不需增加透鏡物鏡單獨完成象差校正，象差校正更高，不需目鏡補償更高鏡像亮度，熒光效果更好（結(jié)象透鏡校正）接視頻效果更好，不需增加照相目鏡第六十五頁，共90頁。第六十六頁，共90頁。相差觀察方式1原理利用被檢物體的光程（折射率x厚度）差進行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過補償面：相位推遲，衍射光通過物鏡相板聚光鏡環(huán)狀光闌第六十七頁，共90頁。相差觀察方式2特點鑒定活體細胞最實用、最經(jīng)濟的方法3缺點需要光強高切片不能太厚(2~10um)蓋片、載片需符合標準最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場物鏡第六十八頁，共90頁。相差觀察方式4應(yīng)用：

無色透明活體標本的細微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細胞(培養(yǎng)細胞,分離細胞)第六十九頁，共90頁。相差觀察方式5調(diào)節(jié)：柯勒照明調(diào)節(jié)將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路（物鏡－聚光鏡相襯環(huán)型號匹配）對樣品聚焦取下目鏡，裝上CT望遠鏡，調(diào)節(jié)CT焦距看到清晰的相差環(huán)調(diào)節(jié)聚光鏡上定位螺絲，使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合第七十頁，共90頁。熒光觀察方法第七十一頁，共90頁。什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光第七十二頁，共90頁。熒光顯微鏡的作用原理寬譜線發(fā)射光（汞燈）濾掉其他光，透過激發(fā)光激發(fā)濾色片吸收濾色片濾掉激發(fā)光，透過熒光標本受激發(fā)產(chǎn)生熒光向四周發(fā)散激發(fā)光受反射、折射或衍射向四周發(fā)散第七十三頁，共90頁。熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長（損失熱能）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率第七十四頁，共90頁。熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點：檢出能力高（放大作用）對細胞的刺激?。梢曰铙w染色）能進行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察——熒光素熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析第七十五頁，共90頁。熒光顯微鏡的主要部件

透射式吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈光源 落射式吸收濾色鏡分光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈光源第七十六頁，共90頁。落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡第七十七頁，共90頁。落射熒光顯微鏡的構(gòu)造第七十八頁，共90頁。熒光顯微鏡光源

汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)

氙燈光源：高峰值更寬，更穩(wěn)定第七十九頁，共90頁。熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組

激發(fā)濾色鏡:激發(fā)波長選擇

激發(fā)透鏡組（激發(fā)塊）:

T%nmBANDPASS入射光發(fā)射光激發(fā)濾色鏡分光濾色鏡吸收濾色鏡第八十頁，共90頁。落射熒光顯微鏡各部件特性和作用吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%A第八十一頁，共90頁。濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收第八十二頁，共90頁。帶寬對圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:B