【課件】2.2動物細胞工程課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)動物細胞培養(yǎng)一

動物細胞培養(yǎng)從社會中來在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚?能不能用自體皮膚的單個細胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚?通過細胞培養(yǎng)構(gòu)建的人造皮膚一

動物細胞培養(yǎng)一、動物細胞培養(yǎng)1．動物細胞工程常用技術(shù)動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合和動物細胞核移植等。(1)常用技術(shù)：(2)基礎(chǔ)：動物細胞培養(yǎng)。2．動物細胞培養(yǎng)(1)概念：從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術(shù)。(2)培養(yǎng)條件①營養(yǎng)屬于合成培養(yǎng)基將細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴格配制而成的培養(yǎng)基。需加入天然成分：血清。是液體培養(yǎng)基，即培養(yǎng)液②無菌、無毒的環(huán)境a．對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行滅菌處理。b．在無菌環(huán)境下進行操作。c．培養(yǎng)液需定期更換，以清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害。a.成分：糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等。b.類型：③溫度、pH和滲透壓a．溫度：以36.5℃±0.5℃為宜。b．pH：以pH為7.2～7.4為宜。c．適宜的滲透壓:④氣體環(huán)境O2作用：細胞代謝所必需的。CO2主要作用：維持培養(yǎng)液的pH。a．動物細胞培養(yǎng)所需氣體主要有O2和CO2。b．在進行細胞培養(yǎng)時，通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶，并將它們置于含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶CO2培養(yǎng)箱維持細胞正常的形態(tài)和功能(3)原理：細胞增殖（有絲分裂）(4)培養(yǎng)過程①體外培養(yǎng)的動物細胞類型懸浮在培養(yǎng)液中生長增殖的細胞②過程動物組織塊用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個細胞問題細胞分裂受阻懸浮生長貼壁生長原因原因細胞密度過大、有害代謝物積累和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等接觸抑制解決傳代培養(yǎng)制成細胞懸液原代培養(yǎng)分瓶①原代培養(yǎng)：指動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)。②細胞貼壁：懸液中分散的細胞往往貼附在培養(yǎng)瓶的瓶壁上。③接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞停止分裂增殖的現(xiàn)象。④傳代培養(yǎng)：分瓶后的細胞培養(yǎng)。單層貼壁的豬輸卵管上皮細胞貼附于某些基質(zhì)表面生長增殖的細胞思考·討論有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題1.幼齡動物的細胞與老齡動物的細胞比較，分化程度低的細胞與分化程度高的細胞比較，哪些細胞更易于培養(yǎng)?為什么?幼齡動物的細胞和分化程度低的細胞更易培養(yǎng)，原因是這些細胞分裂能力強。2.動物細胞培養(yǎng)時，除了添加糖類、氨基酸等必要的營養(yǎng)成分外，往往還需添加血清等一些天然成分。為什么？人們對細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)尚未全部研究清楚，血清等一些天然成分的營養(yǎng)成分比較齊全，可以彌補人工培養(yǎng)基的不足。3．進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是什么？用胃蛋白酶可以嗎？為什么思考·討論蛋白質(zhì)；不可以；多數(shù)動物細胞生存的適宜pH為7.2～7.4，胃蛋白酶(適宜pH為1.5左右)在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適用于細胞培養(yǎng)時的處理。有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題1．動物細胞培養(yǎng)的相關(guān)處理(1)使細胞分散開的原因：一是能保證細胞所需要的營養(yǎng)供應(yīng)；二是能保證細胞內(nèi)有害代謝物的及時排出。(2)使用胰蛋白酶時，要控制好作用時間，因為胰蛋白酶不僅能分解細胞間的蛋白質(zhì)，長時間作用還會分解細胞膜蛋白等，對細胞造成損傷。進行動物細胞培養(yǎng)時不能用胃蛋白酶分散細胞，主要是因為pH不合適。核心歸納(3)動物細胞的整個培養(yǎng)過程中可能多次用到胰蛋白酶或膠原蛋白酶，第一次使用的目的是使組織細胞分散開；貼壁細胞傳代培養(yǎng)時使用的目的是使細胞從瓶壁上脫離下來，分散成單個細胞，便于分瓶后繼續(xù)培養(yǎng)。(4)①懸浮生長細胞：原代培養(yǎng)→分裂受阻→離心法收集→制成細胞懸液傳代培養(yǎng)。②貼壁生長細胞：原代培養(yǎng)→分裂受阻→胰蛋白酶處理→離心法收集→制成細胞懸液傳代培養(yǎng)。核心歸納核心歸納2．植物組織培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理植物細胞的全能性細胞增殖培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基過程外植體↓脫分化愈傷組織

↓再分化芽、根或胚狀體↓生長發(fā)育植物體動物的組織

↓機械法或酶細胞懸液↓原代培養(yǎng)↓細胞懸液↓傳代培養(yǎng)結(jié)果新的植株新的細胞培養(yǎng)基特有成分蔗糖、植物激素葡萄糖、動物血清相同點①兩技術(shù)手段培養(yǎng)過程中都進行有絲分裂，都不涉及減數(shù)分裂；②均需要無菌操作、無菌培養(yǎng)，需要適宜的溫度、pH等條件二、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用1．干細胞的概念：

動物和人體內(nèi)仍保留的少數(shù)具有分裂和分化能力的細胞。在一定條件下，干細胞可以分化成其他類型的細胞。2．干細胞來源：早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。3．干細胞類型：胚胎干細胞和成體干細胞等。4．胚胎干細胞(簡稱ES細胞)電鏡下的胚胎干細胞(照片經(jīng)后期人工上色處理，放大約1500倍)(1)胚胎干細胞的分布：存在于早期胚胎中(3)應(yīng)用實例：具有分化為成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。(2)特點：ES細胞可在體外分化成心肌細胞、神經(jīng)元、造血干細胞等。(4)局限性：胚胎干細胞必須從胚胎中獲取，這涉及倫理問題，因而限制了它在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。5．成體干細胞(1)分布：成體組織或器官內(nèi)的干細胞。(2)類型(3)特點：具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。骨髓中的造血干細胞睪丸中的精原千細胞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)千細胞(4)作用：有著自我更新能力及分化潛能的干細胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復(fù)等密切相關(guān)。(5)應(yīng)用①造血干細胞：治療白血病、一些惡性腫瘤放療或化療后引起的造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病。②神經(jīng)干細胞：治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病等)。6．誘導(dǎo)多能干細胞(1)概念：通過體外誘導(dǎo)成纖維等細胞，獲得類似胚胎干細胞的一種細胞，被稱為誘導(dǎo)多能干細胞(簡稱iPS細胞)。取成纖維細胞等轉(zhuǎn)入相關(guān)因子細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化神經(jīng)元iPS細胞血細胞胰島細胞移植分化腸上皮細胞肝細胞心肌細胞(2)應(yīng)用治療小鼠的鐮狀細胞貧血；現(xiàn)在用iPS細胞治療阿爾茨海默病、心血管疾病等領(lǐng)域的研究也取得了新進展。(3)優(yōu)點：無需破壞胚胎；iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應(yīng)。本節(jié)知識網(wǎng)絡(luò)第2節(jié)動物細胞培養(yǎng)二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體一、動物細胞融合技術(shù)1．概念：使兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的技術(shù)。2．原理：細胞膜的流動性3．誘導(dǎo)融合的方法PEG融合法電融合法滅活病毒誘導(dǎo)法4.結(jié)果：形成雜交細胞。融合后形成的雜交細胞具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細胞融合過程細胞核病毒顆粒細胞核滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。5．意義：細胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。6．應(yīng)用(1)成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。(2)用于制造單克隆抗體。動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞膜的流動性、細胞的全能性細胞膜的流動性步驟酶解法制備原生質(zhì)體，誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)形成雜種植株分散成單個細胞后誘導(dǎo)細胞融合，形成雜交細胞方法聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法、電融合法、離心法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法結(jié)果形成雜種植株形成雜交細胞，以生產(chǎn)細胞產(chǎn)品意義打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種突破有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能核心歸納二、單克隆抗體及其應(yīng)用1．傳統(tǒng)抗體的獲得(1)方法：向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。(2)缺陷：產(chǎn)量低、純度低、特異性差。(1)制備原理①B淋巴細胞特點：一種B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，B淋巴細胞在體外不能無限增殖。②骨髓瘤細胞（癌細胞）特點：能在體外大量增殖，但不能產(chǎn)生抗體。2．單克隆抗體的制備③雜交瘤細胞特點：B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合得到的雜交瘤細胞，既能大量增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體雜交瘤細胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能在體外無限增殖一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體動物細胞融合雜交細胞(2)制備過程用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞多種雜交細胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選:在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞。抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞(分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合)雜交瘤細胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體。單克隆抗體多種雜交細胞(2)制備過程注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。誘導(dǎo)融合的方法有哪些？注射抗原的目的是什么？大量增殖雜交瘤細胞獲得單抗的方法多種B淋巴細胞小鼠注射抗原骨髓瘤細胞融合B-B細胞雜交瘤細胞瘤-瘤細胞選擇培養(yǎng)基

篩選1多種雜交瘤細胞符合要求的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體思考：兩次篩選的目的？抗原-抗體雜交法篩選2克隆化核心探討1．給小鼠注射特定抗原的目的是什么？目的是能從該小鼠的脾中得到可以產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。2．B淋巴細胞與骨髓瘤細胞經(jīng)誘導(dǎo)融合后，培養(yǎng)基中共出現(xiàn)幾種細胞？其中融合的細胞有幾種？(如融合的話，只考慮兩兩融合)，誘導(dǎo)方法有哪些？共有5種細胞；其中融合的細胞有3種。誘導(dǎo)的方法：電融合法、PEG融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法3．單克隆抗體制備過程中，第一次篩選的目的是什么？方法是什么？目的是篩選出雜交瘤細胞；方法是用選擇培養(yǎng)基進行篩選。4．單克隆抗體制備過程中，第二次篩選的目的是什么？方法是什么？其原理是什么？目的是篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞；方法是抗體檢測；其原理是抗原—抗體的特異性結(jié)合。比較項目第一次篩選第二次篩選篩選原因誘導(dǎo)融合后得到多種融合細胞，還有未融合的細胞等由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細胞篩選目的篩選出雜交瘤細胞篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞篩選方法用特定的選擇培養(yǎng)基篩選；未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞單克隆抗體制備過程中兩次篩選的比較核心歸納思考·討論單克隆抗體的應(yīng)用細胞凋亡ADC的作用機制示意圖①ADC被細胞吞噬②⑤ADC抗體藥物接頭思考·討論(1)ADC的抗體和藥物各具有什么作用?(2)除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物?抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞;藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞?？梢杂梅派湫酝凰貥擞泦慰寺】贵w進行靶向放療。一些作用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。思考·討論(1)ADC的抗體和藥物各具有什么作用?(2)除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物?抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞;藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞?？梢杂梅派湫酝凰貥擞泦慰寺】贵w進行靶向放療。一些作用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。3．單克隆抗體的優(yōu)點(1)能準確地識別抗原的細微差異。(2)與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合。(3)可以大量制備。4．單克隆抗體的應(yīng)用(1)作為診斷試劑，如定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。(2)運載藥物，如ADC。(3)治療疾病。資料：(1)細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。(2)免疫的B淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不能在體外長期存活。(3)鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖。如果它的D途徑被阻斷的話，它會因不能合成DNA而死。請根據(jù)上述資料提出篩選出雜交瘤細胞的方法？培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤。思考·討論第2節(jié)動物細胞培養(yǎng)三動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物從社會中來2017年11月27日和12月5日,克隆猴“中中”和“華華”先后在上海誕生。克隆猴的誕生，標志著我國克隆技術(shù)走在了世界前列。靈長類動物是和人類最相似的實驗動物，對研究人類的生殖、發(fā)育和疾病等有著重要意義。克隆動物涉及的生物技術(shù)：體細胞核移植技術(shù)、動物細胞培養(yǎng)技術(shù)、動物細胞融合技術(shù)、早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)、胚胎移植技術(shù)等。其中核心技術(shù)是體細胞核移植技術(shù)。一、動物細胞核移植1．動物細胞核移植技術(shù)概念將動物一個細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，使這個重新組合的細胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育為動物個體的技術(shù)。2．哺乳動物核移植分類種類難易程度原因胚胎細胞核移植相對容易分化程度低，全能性容易表現(xiàn)體細胞核移植十分困難分化程度高，全能性難表現(xiàn)將供體細胞注入去核的卵母細胞。二、體細胞核移植過程從屠宰場收集牛卵巢，采集卵母細胞(左邊照片為研究人員正在使用設(shè)備從牛的卵巢采集卵母細胞)，在體外培養(yǎng)到MII期從供體高產(chǎn)奶牛身體的某一部位(如耳)上取體細胞，進行培養(yǎng)高產(chǎn)奶牛(供體)通過顯微操作去核。通過電融合法使兩細胞融合，供體核進入卵母細胞，形成重構(gòu)胚。用物理或化學(xué)方法(如電刺激、Ca2+載體、乙醇和蛋白酶合成抑制劑等)激活重構(gòu)胚，使其完成細胞分裂和發(fā)育進程生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛將胚胎移入受體(代孕)母牛體內(nèi)二、體細胞核移植過程細胞培養(yǎng)MII期去核細胞融合用物理或化學(xué)方法激活重構(gòu)胚取供體細胞采集卵母細胞供體細胞去核卵母細胞重構(gòu)胚將胚胎移入受體(代孕)母牛體內(nèi)生出與供體遺傳物質(zhì)基本相同的克隆動物將供體細胞注入去核的卵母細胞思考·討論有關(guān)體細胞核移植的問題1.在將體細胞的核移植到卵母細胞之前，為什么必須先對卵母細胞進行去核操作?2.用上述體細胞核移植技術(shù)培育的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎?為什么?為了使核移植的胚胎或動物的核遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞。不是；克隆動物細胞核中的遺傳物質(zhì)來自供體動物，但細胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)同時來自供體細胞和受體卵母細胞。此外，生物性狀還受環(huán)境因素的影響。思考·討論有關(guān)體細胞核移植的問題3.體細胞核移植技術(shù)與誘導(dǎo)iPS細胞相比，有什么相似或不同之處?請你預(yù)測它們應(yīng)用前景的差異。體細胞核移植技術(shù)獲得的重構(gòu)胚和iPS細胞都具有發(fā)育的全能性;不同之處:體細胞核移植技術(shù)需對卵母細胞進行去核操作，誘導(dǎo)iPS細胞需要借助載體將特定基因?qū)爰毎Ｇ熬?體細胞核移植技術(shù)主要應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)獲得克隆動物、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域治療人類疾病;iPS細胞除用于治療人類疾病外，也可用于對體細胞編程機理、細胞再生機理等的研究。1、原理：2、供體：3、受體：（1）選擇原因：動物細胞核的全能性有重要利用價值的動物的體細胞MⅡ期卵母細胞核心歸納動物細胞核移植①體積大，易操作；②MⅡ期卵母細胞的細胞質(zhì)中含有激發(fā)細胞核全能性表達的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。（2）卵母細胞去核：①去核對象：去核去的是紡錘體-染色體復(fù)合物②去核原因：保證克隆動物的核基因全部來自供體細胞③去核方法：常用使用顯微操作法；也可采用梯度離心、紫外線短時間照射和化學(xué)物質(zhì)處理等方法去核或使其中的DNA變性3、將供體細胞整個注入去核卵母細胞中的原因：①對卵母細胞損傷較小；②保證供體細胞的細胞核不被破壞，操作方便。4、克隆動物