實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

選考第33題內(nèi)容：選修1生物技術(shù)實(shí)踐、選修3現(xiàn)代生物科技專題形式：一般10個(gè)填空（1分/空）

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2個(gè)（單項(xiàng)）選擇（2分/題）生物選考試題分布：選擇題：25+3（50+6=56分）非選擇題：3+2（6+7+7+14+10=44分）選修1生物技術(shù)實(shí)踐第一部分微生物的利用實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物第二部分酶的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)4果汁中的果膠和果膠酶實(shí)驗(yàn)6

α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)第三部分生物技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)8果酒及果醋的制作實(shí)驗(yàn)10泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測(cè)定第四部分淺嘗現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)11植物的組織培養(yǎng)第一部分微生物的利用微生物：是指結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，如酵母菌、細(xì)菌、放線菌、霉菌、藍(lán)細(xì)菌和病毒等。絕大多數(shù)微生物與傳染病無(wú)關(guān)，90%以上的微生物是對(duì)人類有益的。微生物有多種用途，許多抗生素來(lái)源于放線菌和霉菌；有些食品由微生物發(fā)酵制成，如酒由酵母發(fā)酵產(chǎn)生，腐乳由紅曲霉和毛霉發(fā)酵制成。實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離基本要求1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。一、大腸桿菌

革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌在腸道中一般對(duì)人無(wú)害但也有一些菌株對(duì)人體是有害的，可侵襲腸粘膜并產(chǎn)生毒素任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。結(jié)晶紫碘液95%乙醇革蘭氏染色法1min革蘭陽(yáng)性

革蘭陰性1min脫色蕃紅復(fù)染菌落（colony）：一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上發(fā)展成一個(gè)肉眼可見，具一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群。光滑型菌落粗糙型菌落二、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離1、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：移液槍接種環(huán)玻璃刮刀超凈工作臺(tái)（保證無(wú)菌環(huán)境）高壓蒸汽滅菌鍋恒溫培養(yǎng)箱搖床2、培養(yǎng)基：平板斜面固體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL瓊脂：1g液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基調(diào)pH值菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）3、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿滅菌

——高壓蒸汽滅菌法

將配制好的50mlLB液體和固體培養(yǎng)基分別裝入250ml三角瓶中，加上封口膜；

將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好；置于滅菌鍋內(nèi)1kg壓力滅菌15min

（121℃）無(wú)菌技術(shù)

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脫脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各種金屬、塑料、封口膜及硅膠帽，它們只可讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。（160℃2h或170℃1h）高壓蒸汽滅菌法：玻璃器皿、金屬、移液槍頭等（火焰）灼燒：接種環(huán)、試管口、三角燒瓶口紫外燈+過(guò)濾風(fēng)：超凈臺(tái)滅菌消毒：如75%酒精棉球（消毒：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部分致病微生物的過(guò)程。）（2）倒平板

滅菌后，待滅菌鍋壓力與大氣壓力相同時(shí)打開鍋蓋將有培養(yǎng)基的三角瓶和培養(yǎng)皿放到超凈臺(tái)上打開超凈臺(tái)的紫外燈和過(guò)濾風(fēng)，待固體培養(yǎng)基冷卻到60℃時(shí)，關(guān)閉紫外燈用酒精棉球消毒桌面和手。倒平板：10-12ml培養(yǎng)基/培養(yǎng)皿

每倒入一個(gè)后立即置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，并形成平面。酒精燈旁：左手？右手？制作試管斜面：

將配制好的呈熔化狀態(tài)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管中時(shí)必須用三角漏斗

滅菌試管冷卻到50℃左右，把試管棉塞一端擱在玻棒上，待冷凝后即成試管斜面

將分裝好的含培養(yǎng)基的試管滅菌P21小字部分1/3在試管外，2/3在試管內(nèi)正確不正確棉塞制作（3）接種培養(yǎng)

左手：將大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，靠近酒精燈火焰；

右手：拿接種環(huán)，并用無(wú)名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使環(huán)接觸培養(yǎng)基，再取菌體；

將菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，瓶口封口膜和管口棉塞復(fù)原；

將三角瓶置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。（4）劃線分離

在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)；

將搖床上培養(yǎng)了12h的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中；

在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次，劃線后蓋好培養(yǎng)皿；

將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下面），放到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h后，可看到在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明菌已被分離。劃線分離法劃線的起點(diǎn)要有菌，且每一次新的起點(diǎn)應(yīng)比前一次的起點(diǎn)菌含量（濃度）低劃線的最終點(diǎn)不能與前面的劃線點(diǎn)重疊除第1次外，其余幾次劃線前，都要將接種環(huán)火焰灼燒恒溫培養(yǎng)箱平板倒置防