實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

選考第33題內(nèi)容：選修1生物技術(shù)實(shí)踐、選修3現(xiàn)代生物科技專題形式：一般10個(gè)填空（1分/空）

+

2個(gè)（單項(xiàng)）選擇（2分/題）生物選考試題分布：選擇題：25+3（50+6=56分）非選擇題：3+2（6+7+7+14+10=44分）選修1生物技術(shù)實(shí)踐第一部分微生物的利用實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物第二部分酶的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)4果汁中的果膠和果膠酶實(shí)驗(yàn)6

α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測第三部分生物技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)8果酒及果醋的制作實(shí)驗(yàn)10泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測定第四部分淺嘗現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)11植物的組織培養(yǎng)第一部分微生物的利用微生物：是指結(jié)構(gòu)簡單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，如酵母菌、細(xì)菌、放線菌、霉菌、藍(lán)細(xì)菌和病毒等。絕大多數(shù)微生物與傳染病無關(guān)，90%以上的微生物是對人類有益的。微生物有多種用途，許多抗生素來源于放線菌和霉菌；有些食品由微生物發(fā)酵制成，如酒由酵母發(fā)酵產(chǎn)生，腐乳由紅曲霉和毛霉發(fā)酵制成。實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離基本要求1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。一、大腸桿菌

革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌在腸道中一般對人無害但也有一些菌株對人體是有害的，可侵襲腸粘膜并產(chǎn)生毒素任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。結(jié)晶紫碘液95%乙醇革蘭氏染色法1min革蘭陽性

革蘭陰性1min脫色蕃紅復(fù)染菌落（colony）：一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上發(fā)展成一個(gè)肉眼可見，具一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群。光滑型菌落粗糙型菌落二、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離1、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：移液槍接種環(huán)玻璃刮刀超凈工作臺（保證無菌環(huán)境）高壓蒸汽滅菌鍋恒溫培養(yǎng)箱搖床2、培養(yǎng)基：平板斜面固體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL瓊脂：1g液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基調(diào)pH值菌膜菌沉淀均勻渾濁對照液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）3、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿滅菌

——高壓蒸汽滅菌法

將配制好的50mlLB液體和固體培養(yǎng)基分別裝入250ml三角瓶中，加上封口膜；

將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好；置于滅菌鍋內(nèi)1kg壓力滅菌15min

（121℃）無菌技術(shù)

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脫脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各種金屬、塑料、封口膜及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。（160℃2h或170℃1h）高壓蒸汽滅菌法：玻璃器皿、金屬、移液槍頭等（火焰）灼燒：接種環(huán)、試管口、三角燒瓶口紫外燈+過濾風(fēng)：超凈臺滅菌消毒：如75%酒精棉球（消毒：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部分致病微生物的過程。）（2）倒平板

滅菌后，待滅菌鍋壓力與大氣壓力相同時(shí)打開鍋蓋將有培養(yǎng)基的三角瓶和培養(yǎng)皿放到超凈臺上打開超凈臺的紫外燈和過濾風(fēng)，待固體培養(yǎng)基冷卻到60℃時(shí)，關(guān)閉紫外燈用酒精棉球消毒桌面和手。倒平板：10-12ml培養(yǎng)基/培養(yǎng)皿

每倒入一個(gè)后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，并形成平面。酒精燈旁：左手？右手？制作試管斜面：

將配制好的呈熔化狀態(tài)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管中時(shí)必須用三角漏斗

滅菌試管冷卻到50℃左右，把試管棉塞一端擱在玻棒上，待冷凝后即成試管斜面

將分裝好的含培養(yǎng)基的試管滅菌P21小字部分1/3在試管外，2/3在試管內(nèi)正確不正確棉塞制作（3）接種培養(yǎng)

左手：將大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，靠近酒精燈火焰；

右手：拿接種環(huán)，并用無名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使環(huán)接觸培養(yǎng)基，再取菌體；

將菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，瓶口封口膜和管口棉塞復(fù)原；

將三角瓶置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。（4）劃線分離

在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)；

將搖床上培養(yǎng)了12h的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中；

在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次，劃線后蓋好培養(yǎng)皿；

將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下面），放到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h后，可看到在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明菌已被分離。劃線分離法劃線的起點(diǎn)要有菌，且每一次新的起點(diǎn)應(yīng)比前一次的起點(diǎn)菌含量（濃度）低劃線的最終點(diǎn)不能與前面的劃線點(diǎn)重疊除第1次外，其余幾次劃線前，都要將接種環(huán)火焰灼燒恒溫培養(yǎng)箱平板倒置防