RNA的提取和cDNA合成原理和實(shí)驗(yàn)方法

RNA的提取和cDNA合成原理和實(shí)驗(yàn)方法第一節(jié).概述從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA，通過酶促反響逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，將雙鏈cDNA和載體連接，然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，即可獲得cDNA文庫(kù),構(gòu)建的cDNA文庫(kù)可用于真核生物基因的構(gòu)造、表達(dá)和調(diào)控的分析；比擬cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的根本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來(lái)，已開展了許多種提高cDNA合成效率的方法，并大大改良了載體系統(tǒng)，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的根本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，聚合酶合成cDNA第二鏈，參加合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當(dāng)載體(噬菌體或質(zhì)粒)。一.RNA制備模板mRNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的構(gòu)造特點(diǎn)，容易受RNA酶的攻擊反響而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性，這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換〔使用一次性手套〕。所用的玻璃器皿需置于枯燥烘箱中2T烘烤2小時(shí)以上。但凡不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈°DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反響而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物，因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理，參加DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌吟作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反響，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾的試劑。除DEPC夕卜,也可用異硫氯酸胍、機(jī)氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了防止mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。細(xì)胞總RNA制備方法很多，如異硫氯酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。別離的總RNA可利用mRNA3'末端含有多聚(A)+的特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí),在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70P可保存一年以上。二.cDNA第一鏈的合成所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來(lái)催化反響。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中別離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個(gè)具有假設(shè)干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對(duì)DNA:RNA雜交體的RNA局部進(jìn)展切降解(RNA酶H活性)MLV反轉(zhuǎn)錄O酶只有單個(gè)多肽亞基，兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱，且對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長(zhǎng)的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時(shí)的最適pH值，最適鹽濃度和最適溫室各不一樣，所以合成第一鏈時(shí)相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來(lái)起始DNA的合成°cDNA合成最常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長(zhǎng)的oligo(dT)。三.cDNA第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種：自身引導(dǎo)法合成的單鏈cDNA3'端能夠形成一短的發(fā)夾構(gòu)造，這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物，當(dāng)?shù)谝绘満铣煞错懏a(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈，最后用對(duì)單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán)，即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反響，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾構(gòu)造時(shí)無(wú)一例外地將導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA5'端序列出現(xiàn)缺失和重排，因而該方法目前很少使用。置換合成法該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切和缺。從而產(chǎn)生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物，在大腸桿菌DNA聚合酶1的作用下合成第二鏈。該反響有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：(1)非常有效；(2)直接利用第一鏈反響產(chǎn)物，無(wú)須進(jìn)一步處理和純化；(3)不必使用S1核酸酶來(lái)切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。四.cDNA的分子克隆已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)?；蚴删w中，為此，首先必需連接上接頭(Linker)，接頭可以是限制性切酶識(shí)別位點(diǎn)片段，也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴，退火后形成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)展擴(kuò)增。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入適當(dāng)載體。第二節(jié).動(dòng)植物組織mRNA的提取一、材料水稻葉片或小鼠肝組織。二、設(shè)備研缽，冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，低溫冰箱，冷凍真空枯燥器，紫外檢測(cè)儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑1、無(wú)RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶〔180。。2小時(shí)〕裝蒸餾水，然后參加0.01%的DEPC〔體積/體積〕，處理過夜后高壓滅菌。2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，〔用高溫滅菌器皿配制〕，然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、M層析柱加樣緩沖液；20mmol/LTrisCl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1%SDS。4、洗脫緩沖液：10mmol/LTrisCl(pH7.6)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.05%SDS。四、操作步驟〔一〕動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+別離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-1mg組織參加1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液參加0.2ml的比例參加氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。3、取上層水相于一新的離心、管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例參加異丙醇，室溫放置10分鐘，120g離心10分鐘。4、棄去上清液，按每mlTrizol液參加至少1ml的比例參加75%乙醇，渦旋混勻，4。下75g離心5分鐘。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空枯燥5-10分鐘，注意不要枯燥過分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55°C-60°C水溶10分鐘。RNA可進(jìn)展mRNA別離，或貯存于70%乙醇并保存于-70C。［注意］1、整個(gè)操作要帶罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。2、加氯仿前的勻漿液可在-70C保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保存一周，-20C保存一年。〔二〕mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，當(dāng)總RNA流徑。ligo(dT)纖維素時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在。ligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次。ligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。1、用0.1mol/LNaOH懸浮0.5-1.0goligo(dT)纖維素。2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、用1*柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、將〔一〕中提取的RNA液于65C溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，參加等體積2*柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，參加1倍柱床體積的1*層析柱加樣溶液。5、測(cè)定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)，參加2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。6、測(cè)定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。7、參加1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20C30分鐘。8、4C下120g離心15分鐘，小心、棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4C下120g離心5分鐘。9、小心棄去上清液，沉淀空氣枯燥10分鐘，或真空枯燥10分鐘。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成〔或保存在70%乙醇中并貯存于-70C〕。［注意］1、mRNA在70%乙醇中-70C可保存一年以上。2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并參加0.02%疊氮鈉〔NaN3〕冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節(jié)植物病毒RNA提取大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性一樣，植物病毒RNA提取較為簡(jiǎn)單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。一、材料提純TMV病毒液〔10mg/ml〕。二、設(shè)備冷凍臺(tái)式離心機(jī)，低溫真空枯燥儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑TE-飽和酚:氯仿〔1:1〕，氯仿，3MNaAc(pH5.2)，乙醇(1%和70%)，TE緩沖液，無(wú)RNA酶的雙菌水。四、操作步驟1、取一eppendorf管參加提純TMV〔10mg/ml〕4ml，再參加等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4C下120g離心10分鐘。2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機(jī)相交界面無(wú)蛋白為止。3、吸取水相于新eppendorf心管，參加等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4，C下120g離心10分鐘。4、取水相，參加1/10倍體積的3mol/LNaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20C30分鐘。5、4C下120g離心15分鐘，小心、棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4C下120g離心5分鐘。6、小心棄去上清液，沉淀真空枯燥5分鐘或空氣枯燥10分鐘，并溶于無(wú)RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。7、取10ml進(jìn)展電泳分析，另10ml用于cDNA合成。[注意]1、整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)展。2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍?，一般需要屢次進(jìn)展酚/氯仿的抽提。第四節(jié)cDNA合成技術(shù)一、RibocloneM-MLV(H-)cDNA合成技術(shù)Promega公司的RibocloneRM-MLV(H-)cDNA合成系統(tǒng)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH缺失突變株取代AMV反轉(zhuǎn)錄酶，使合成的cDNA更長(zhǎng)。該系統(tǒng)的第一鏈合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶I進(jìn)展置換合成,最后用T4DNA聚合酶切去單鏈末端，方法簡(jiǎn)便易行。該系統(tǒng)試劑包括：Pg特異性引物2plM-MLV第一鏈緩沖液(5方，配方如下：250mmol/LTrisClpH8.3(37C時(shí))；375mmol/lKCl;15mmol/LMgCl2;50mmol/LDTT;10mmol/LdATP,dCTP,dGTP,dTTP混合物(各2.5mmol/L)2>625prRNasinRRNA酶抑制劑10,0pM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH-5ng對(duì)照RNA4plM-MLV第二鏈緩沖液(10方，配方如下：4mmol/LTrisCl,pH7.2;850mmol/LKCl;44mmol/LMgCl2;30mmol/LDTT;0.5mg/mlBSA。5pRNaseH5pDNA聚合酶I1pT4DNA聚合酶I2>1.25ml不含核酸酶的水以上所有試劑除對(duì)照RNA需在-70C保存外，其余均可保存于-20C，可以合成40pgmRNA?！惨弧车谝绘満铣?.試劑[a-32P]dCTP(>4Ci/mmol)，EDTA(50mM和2mM)，TE-飽和酚:氯仿〔1:1〕，7.5MNH4Ac，乙醇(1%和70%)，TE緩沖液。2.操作步驟取一滅菌的無(wú)RNA酶的eppendorf管，參加RNA模板和適當(dāng)引物，每pgRNA使用0.5pg引物(如使用NotI引物接頭，使用0.3pg),用H2O調(diào)整體積至15pl,70C處理5分鐘，冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次參加5>第一鏈緩沖液5plrRNasinRNA酶抑制劑25UM-MLV(H-)反轉(zhuǎn)錄酶2UH2O調(diào)至總體積25pl用手指輕彈管壁，吸取5pl至另一eppendorf管，參加2-5pCi[a-32P]dCTP(＞4Ci/mmol),用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。37T(隨機(jī)引物)或42T(其它引物)溫浴1小時(shí)取出置于冰上摻入測(cè)定的eppendorf管參加95nl50mMEDTA終止反響，并使總體積為1p1?？扇?0pl進(jìn)展電泳分析(先用苯酚抽提)，另10pl進(jìn)展同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成注：以上25pl反響總體積中所用RNA量為1pg，如合成5pgRNA，則可按比例擴(kuò)大反響體積，倒5pgRNA使用125pil總體積進(jìn)展合成?！捕车诙満铣?、取第一鏈反響液20pl，再依次參加10＞第二鏈緩沖液20plDNA聚合酶123pRNaseH0.8pH2O加至終體積為1pl2、輕輕混勻，如需進(jìn)展第二鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定，可取出10pl至另一eppendorf管，參加2-5pCi[a-32P]dCTP。3、14T溫浴2小時(shí)(如需合成長(zhǎng)于3kb的cDNA，則需延長(zhǎng)至3-4小時(shí))。4、摻入測(cè)定eppendorf管中參加90pl50mMEDTA，取10pl進(jìn)展同位素?fù)饺敕派湫詼y(cè)定，余下的可進(jìn)展電泳分析。5、cDNA第二鏈合成離心管反響液70P處理10分鐘，低速離心后置冰上。6、參加2pT4DNA聚合酶，37°C溫浴10分鐘。7、參加10pl2mmol/LEDTA終止反響。8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反響液，離心2分鐘。9、水相移至另一eppendorf管，參加0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉，pH5.2)，混勻后再參加2.5倍體積的冰冷乙醇(-20C)，-20C放置30分鐘后離心5分鐘。10、小心丟去上清液，參加0.5ml冰冷的70%乙醇，離心2分鐘。11、小心移去上清液，枯燥沉淀。12、沉淀溶于10-20plTE緩沖液?！踩惩凰?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定、計(jì)算和電泳分析試劑1mg/ml鮭魚精DNA,三氯乙酸(TCA，5%和7%),堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，〔30mMNaOH,1mMEDTA〕，2＞樣品緩沖液，〔20mMNaOH,20%甘油，0.025%溴酚藍(lán)〕。操作步驟各取一2(5)中和二⑷反響液各3pl，點(diǎn)于玻璃纖維濾紙，室溫枯燥，這些樣品代表總放射性活性。同樣各取3pl中反響液至含有1pl(1mg/ml)鮭魚精DNA中，混勻，參加0.5ml5%TCA，渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。用玻璃纖維濾紙過濾，用冰冷的5%TCA洗三次，每次用5mlTCA，再用5ml丙酮或乙醇漂洗，這些樣品代表?yè)饺敕派湫曰钚浴７謩e測(cè)定總放射性活性強(qiáng)度和摻入放射性活性強(qiáng)度，可用蓋革計(jì)算器，也可用液閃計(jì)數(shù)。3.第一鏈產(chǎn)量測(cè)定第一鏈摻入率(%)=摻入cpm/總cpm>1%摻入dNTP(nmol)=2nmoldNTP/pl阪響體積(pl)>(第一鏈摻入率)設(shè)330為每moldNTP的平均分子量合成cDNA量(ng)=摻入dNTP(nmol)>330ng/nmolmRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率=合成cDNA量(ng)/模板RNA量(ng)>1%例如總放射性活性強(qiáng)度為254,0cpm,摻入放射性活性強(qiáng)度為3040cpm,所用RNA摸板量為1ng,反響體積為25pl,則：摻入率=3040/2540>1%=1.2摻入dNTP量=2nmoldNTP/pl>25>1.2%=0.6nmol合成cDNA量=0.6nmoldNTP>330ng/nmol=198ngmRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率=198nm/10ng彳%=19.8%由于10ngRNA中20%(5nl/25nl)用于摻入測(cè)定，而反響體積占總體積80%,因而實(shí)際第一鏈cDNA合成量為0.8>198ng=158ngo第二鏈產(chǎn)量計(jì)算除需去除第一鏈摻入dNTP夕卜，方法同第一鏈產(chǎn)量計(jì)算第二鏈摻入率=摻入放射性活性/總放射性活性““摻入dNTP量(nnol)=[0.4nmoldNTP/^l>反響體積(nl)-第一鏈摻入nmol]>第二鏈摻入率第二鏈cDNA合成量(ng)=nmoldNTP>330ng/nmol雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/單鏈cDNA合成