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文檔簡(jiǎn)介
1核酸是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的主要研究對(duì)象,許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步都要進(jìn)行核酸的提取,如PCR、基因測(cè)序及分子克隆等.提取核酸的種類(lèi):真核細(xì)胞基因組DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA及mRNA第1頁(yè)/共32頁(yè)2
提取的核酸樣品的完整性和純度直接關(guān)系到最后實(shí)驗(yàn)的結(jié)果鑒定技術(shù):
分光光度技術(shù):樣品定量、純度鑒定凝膠電泳技術(shù):樣品定量、純度鑒定分子量測(cè)定、分離核酸片段第2頁(yè)/共32頁(yè)3第一節(jié)核酸分離與純化的基本過(guò)程一、材料與方法
1.材料:血液、尿液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞
2.方法:保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性原則排除其他分子的污染,保證樣品的純度第3頁(yè)/共32頁(yè)4二、技術(shù)路線(xiàn)
1.核酸的釋放
破碎細(xì)胞,釋放核酸
方法:機(jī)械法破壞線(xiàn)性DNA
非機(jī)械法
2.核酸的分離與純化大分子污染物污染物非需要的核酸分子對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響的溶液和試劑
第4頁(yè)/共32頁(yè)5
3.核酸的濃縮、沉淀與洗滌濃縮:
沉淀:有機(jī)溶劑沉淀法原理:
洗滌:用70%~75%乙醇去除沉淀中的鹽第5頁(yè)/共32頁(yè)6
4、鑒定與保存
1.)核酸的鑒定濃度、純度、完整性
①濃度鑒定
a紫外分光光度法260nm
在標(biāo)準(zhǔn)條件下,1個(gè)吸光度單位相當(dāng)于
50g/ml的雙鏈DNA38g/ml的單鏈DNA或RNA33g/ml的單鏈寡聚核苷酸
b熒光光度法
熒光染料:溴化乙錠
發(fā)出橙紅色熒光
第6頁(yè)/共32頁(yè)7
②純度鑒定
a紫外分光光度法:測(cè)A260/A280的比值判斷是否有蛋白質(zhì)污染
(為什么)
A260/A280比值為1.8,純DNAA260/A280比值為2.0,純RNAb熒光光度法:用溴化乙錠為染料示蹤核酸電泳結(jié)果判斷純度第7頁(yè)/共32頁(yè)8
③完整性鑒定:用溴化乙錠為染料示蹤核酸電泳結(jié)果判斷完整性。
2)核酸的保存
①
DNA的保存
pH影響DNA穩(wěn)定性pH7.0~8.0EDTA減少二價(jià)金屬離子氯仿防止細(xì)菌污染溫度低溫-70℃保存數(shù)年
4℃保存第8頁(yè)/共32頁(yè)9
②
RNA的保存
a0.3mol/L的醋酸鈉或雙蒸水,-70℃~-80℃。若加入RNA酶抑制劑可延長(zhǎng)保存時(shí)間。
b將RNA沉淀溶于70%乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中,-20℃可長(zhǎng)期保存。
小量分裝保存第9頁(yè)/共32頁(yè)10第二節(jié)基因組DNA的分離與純化一、分離與純化的方法
1.酚抽提法:EDTA裂解緩沖液SDS裂解細(xì)胞蛋白酶KRNA酶
pH8.0的Tris飽和酚抽提醋酸銨、無(wú)水乙醇沉淀70%乙醇洗滌DNA
第10頁(yè)/共32頁(yè)11第11頁(yè)/共32頁(yè)122.DNA樣品的進(jìn)一步純化方法:透析、層析、電泳、選擇性沉淀聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第12頁(yè)/共32頁(yè)13二、DNA片段的回收
(一)原則與要求
1.提高DNA片段的回收率
2.除去回收DNA樣品中的污染
(二)回收方法:
1.DEAE纖維素膜插片電泳法瓊脂糖凝膠
2.電泳洗脫法
3.壓碎與浸泡法聚丙烯酰胺凝膠第13頁(yè)/共32頁(yè)14第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化一、提取與純化基本過(guò)程:細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解提取質(zhì)粒
1.提取方法:堿裂解法煮沸裂解法
SDS裂解法
2.純化方法:氯化銫-溴化乙錠等密度梯度超速離心法(CsCI-EB法)聚乙二醇沉淀法第14頁(yè)/共32頁(yè)15
裂解細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)、染色體變性釋放質(zhì)粒DNA調(diào)pH中性質(zhì)粒DNA恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)沉淀(質(zhì)粒DNA溶于上清液中)取上清液無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNApH12.0~12.6高濃度鹽第15頁(yè)/共32頁(yè)16第16頁(yè)/共32頁(yè)17二、質(zhì)粒DNA的回收提取純化的質(zhì)粒DNA凝膠電泳回收第17頁(yè)/共32頁(yè)18第四節(jié)RNA的分離與純化rRNA80~85%tRNA15~20%總RNAmRNA1~5%
mRNA一、RNA制備的條件與環(huán)境
RNase
注意:1.細(xì)胞外RNase的污染
2.
抑制細(xì)胞內(nèi)RNase
第18頁(yè)/共32頁(yè)19措施:1.潔凈的實(shí)驗(yàn)室
2.戴手套與口罩
3.一次性的實(shí)驗(yàn)材料和新包裝的試劑
4.玻璃器皿用DEPC處理
5.冰浴條件下進(jìn)行操作第19頁(yè)/共32頁(yè)20二、總RNA的分離與純化(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法硫氰酸胍+β-巰基乙醇裂解細(xì)胞酚/氯仿抽提裂解溶液異丙醇沉淀75%乙醇洗滌RNApH4.0第20頁(yè)/共32頁(yè)21三、mRNA的分離與純化
細(xì)胞內(nèi)mRNA特點(diǎn):含量少種類(lèi)多分子大小不一
mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn):多聚腺苷酸尾(polyA)方法:oligo(dT)-纖維素柱層析法
oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法第21頁(yè)/共32頁(yè)22第22頁(yè)/共32頁(yè)23第五節(jié)DNA測(cè)序
主要方法:
雙脫氧末端終止法
Maxam-Gilbert化學(xué)降解法
DNA自動(dòng)化測(cè)序第23頁(yè)/共32頁(yè)24一、雙脫氧末端終止法原理:模板:?jiǎn)捂淒NA(待測(cè)序的DNA)酶:大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ
引物:5`端標(biāo)記的寡核苷酸鏈底物:dNTP(AGCT)
ddNTP(AGCT)第24頁(yè)/共32頁(yè)25
反應(yīng)體系:四組獨(dú)立的反應(yīng)體系每組均含有dNTP(AGCT)
ddNTP(一種)
操作:
1.獲得標(biāo)記片段組
2.電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
3.顯影
4.讀序第25頁(yè)/共32頁(yè)26第26頁(yè)/共32頁(yè)27第27頁(yè)/共32頁(yè)28二、Maxam-Gilbert化學(xué)降解法
待測(cè)DNA標(biāo)記四組獨(dú)立反應(yīng)體系針對(duì)某一種堿基進(jìn)行切割第2
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