標(biāo)準(zhǔn)解讀
《GB/T 21103-2007 動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR方法》是一項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn),旨在通過實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對動物源性飼料中的哺乳動物源性成分進(jìn)行定性的檢測。該標(biāo)準(zhǔn)適用于各種動物源性飼料,包括但不限于肉骨粉、魚粉等產(chǎn)品,用于判斷其中是否含有來自特定哺乳動物的DNA片段。
標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了從樣品準(zhǔn)備到最終結(jié)果分析的全過程。首先,在樣品制備階段,需要將待測樣品按照一定比例與提取緩沖液混合,并通過物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)以釋放DNA。接下來是DNA提取過程,使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒或其他適合的方法從處理過的樣品中分離出總DNA。獲得的DNA需經(jīng)過純化步驟去除可能干擾后續(xù)反應(yīng)的物質(zhì)。
在完成DNA提取后,采用特異性引物和探針設(shè)計(jì)針對目標(biāo)哺乳動物種類特有的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。這些引物和探針的選擇基于已知的不同哺乳動物之間存在差異但又足夠保守的區(qū)域,確保能夠準(zhǔn)確識別目標(biāo)物種而不與其他非目標(biāo)生物混淆。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系通常包含dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2以及優(yōu)化后的退火溫度等條件設(shè)置,以便于高效地復(fù)制目標(biāo)DNA片段并同時(shí)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)度變化。
整個實(shí)驗(yàn)過程中需要注意避免交叉污染,如使用無菌技術(shù)和設(shè)備、設(shè)立陽性對照及陰性對照來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的有效性和準(zhǔn)確性。最后,根據(jù)Ct值(循環(huán)閾值)來判斷樣品中是否存在指定哺乳動物源性成分:如果樣品的Ct值小于等于設(shè)定閾值,則認(rèn)為該樣品中含有相應(yīng)的哺乳動物DNA;反之則為陰性結(jié)果。
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- 現(xiàn)行
- 正在執(zhí)行有效
- 2007-10-24 頒布
- 2008-04-01 實(shí)施
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GB/T 21103-2007動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR方法-免費(fèi)下載試讀頁文檔簡介
犐犆犛65.120
犅46
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
犌犅/犜21103—2007
動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性
檢測方法實(shí)時(shí)熒光犘犆犚方法
犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犿犪犿犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊犻狀犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犪狋犲犱犳犲犲犱狊狋狌犳犳狊—
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20071024發(fā)布20080401實(shí)施
中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局
發(fā)布
中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會
書
犌犅/犜21103—2007
前言
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位:中華人民共和國遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局、寶生物工程(大連)有限公司、中國
檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國山東出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國深圳出入境檢驗(yàn)檢疫
局、中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:曹際娟、李晶泉、鄭秋月、徐昊、張舒亞、于愛麗、王玉萍、陳穎、徐寶梁、高宏偉、
宗卉、金東權(quán)。
本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。
Ⅰ
書
犌犅/犜21103—2007
動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性
檢測方法實(shí)時(shí)熒光犘犆犚方法
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源性飼料中哺乳動物源性成分(包括牛、綿羊、山羊、豬、兔、鹿、馬、驢、狗、貓等)
實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法,該檢測方法的檢出限為0.1%。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于動物源性飼料中哺乳動物源性成分的定性檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有
的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn),然而,鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究
是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
GB/T14699.1飼料采樣(GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT)
SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求
3術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1
實(shí)時(shí)熒光犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
3.2
犆狋值犮狔犮犾犲狋犻犿犲
每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
4原理
采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),根據(jù)線粒體DNA的12S核糖體RNA(12SribosomalRNA,
12SrRNA)基因上哺乳動物與非哺乳動物種間序列差異而進(jìn)行哺乳動物源性成分鑒定。利用裂解液破
碎細(xì)胞,三氯甲烷抽提蛋白質(zhì),異丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。
以實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù),采用多重PCR方法,將所用試劑配制成預(yù)混合形式,組建成實(shí)時(shí)熒光PCR哺乳
動物DNA檢測試劑盒。在同一反應(yīng)管內(nèi)對哺乳動物的12SrRNA基因及內(nèi)參照基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增,
并通過標(biāo)記兩種不同熒光物質(zhì)6羧基熒光素(6carboxyfluorescein,FAM)、5六氯熒光素(5hexachlo
rofluorescein,HEX)的探針進(jìn)行特異性雜交,兩色熒光同步檢測。其中,對內(nèi)參照反應(yīng)的檢測,可以監(jiān)
控反應(yīng)是否正常進(jìn)行,防止假陰性結(jié)果。觀察實(shí)時(shí)熒光
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