對(duì)蝦養(yǎng)殖生物學(xué)WSSV

對(duì)蝦養(yǎng)殖生物學(xué)WSSV第一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日WSSV的形態(tài)學(xué)WSSV屬線頭病毒科Nimaviridae，完整包膜的病毒體（粒子）長(zhǎng)210-380nm，最寬處70-167nm。用負(fù)染電鏡觀察，WSSV的病毒體末端具尾狀附器(tail-likeappendage)。膜厚6-7nm，為脂質(zhì)三層膜結(jié)構(gòu)，由不透明電子層分隔成兩層透明層。核衣殼位于膜內(nèi)，為彈簧體型結(jié)構(gòu)，由直徑10nm的球形蛋白亞基構(gòu)成。這些蛋白亞基沿長(zhǎng)軸垂直排列成，每22nm就有4-15層，使核殼體呈斜紋格形。核殼體從膜里出來(lái)后變長(zhǎng)，表明它是緊緊壓縮在病毒體內(nèi)。各核衣殼規(guī)格各異，長(zhǎng)度變化在180-420nm之間，寬在54-85nm之間，具有厚6nm的外壁。第二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日無(wú)包涵體的桿狀病毒，橫切片為圓形。核衣殼一端鈍圓，另一端為平頭，表面有分段的與與病毒粒子的長(zhǎng)軸垂直的15節(jié)花紋結(jié)構(gòu)，為指環(huán)域堆(ring-structure)積形成，每個(gè)指環(huán)結(jié)構(gòu)為由一排直徑為10的亞單位。第三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日第一個(gè)被測(cè)得的基因組遺傳密碼的海洋生物病毒、目前已測(cè)得的最大的動(dòng)物病毒之一。第四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基因組及其分類

環(huán)形雙鏈DNA分子，A+T含量占59%，分布均勻。不同隔離群的基因組大小各異，如中國(guó)大陸的WSSV為305kbp，臺(tái)灣省的307kbp，泰國(guó)的293

kbp。

第五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日WSSV的結(jié)構(gòu)蛋白有40多種蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)病毒增殖和/或DNA復(fù)制調(diào)節(jié)過(guò)程中，還有結(jié)構(gòu)蛋白。WSSV病毒體內(nèi)至少有38種結(jié)構(gòu)蛋白，其中膜上有21種，核衣殼中有10種，間層膜和核衣殼之間有5種。在膜蛋白VP31、VP110和VP281、間層蛋白VP36A和核衣殼蛋白VP664上有細(xì)胞附著基序，對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞有重要作用。其它蛋白（如VP28、VP39B、VP41A、VP51A、VP51B、VP68、VP124、VP150、VP187、VP281和VP292）和膠原狀蛋白位于膜內(nèi)；而蛋白VP35、VP466、VP15和VP76位于核衣殼上，具有不同的功能?？贵w分析表明，VP28和VP24可能與病毒的穿透作用有關(guān)。最近發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦血細(xì)胞中的25-Kda膜蛋白能結(jié)合到重組VP28，即WSSV病毒體上。這種蛋白質(zhì)與小分子GTP-結(jié)合蛋白R(shí)ab7高度同源。以Rab7抗體進(jìn)行的中和試驗(yàn)表明，它能抑制WSSV病毒體與細(xì)胞結(jié)合，減少WSSV感染后的死亡。第六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日用RNA干擾法研究與VP19相對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)雙鏈RNA能誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦特殊的抗病毒反應(yīng)，抑制WSSV感染，大幅度降低死亡率。而相應(yīng)的VP28、VP281、WSSV蛋白激酶（PK）及不相關(guān)的綠色熒光蛋白的長(zhǎng)雙鏈RNA能提高中國(guó)明對(duì)蝦的成活率，用VP28和PK雙鏈RNA處理的對(duì)蝦成活率最高。連續(xù)3次注射短小的VP28干擾RNA，完全抑制了WSSV對(duì)日本對(duì)蝦的感染。第七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日WSSV基因組含531-684個(gè)閱讀框，具ATG啟動(dòng)密碼子，其中181-184閱讀框編碼含51-6077個(gè)氨基酸組成的功能蛋白，相當(dāng)于基因組遺傳信息的92%。約21%-29%的閱讀框編碼WSSV蛋白，即與其他已知蛋白相同。這些蛋白包括核酸代謝和DNA復(fù)制酶，如DNA聚合酶、非特異性核酸酶、核苷酸還原酶的大小亞基、胸苷激酶、胸苷酸激酶、嵌合的胸苷-胸苷酸激酶、胸苷酸合成酶、dUTP酶和兩種激酶。推測(cè)還有其他功能蛋白，如膠原狀蛋白、鞭毛蛋白、幾丁質(zhì)酶、蛹?xì)畹鞍住⒓?xì)胞表面絮狀蛋白、kunitz狀蛋白酶抑制因子1類細(xì)胞因子受體、sno狀肽和嵌合抗凋亡蛋白。有3個(gè)閱讀框（泰國(guó)隔離群的151、366和418）可編碼WSSV潛伏期的蛋白。第八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日WSSV還有3個(gè)能立即轉(zhuǎn)錄的即時(shí)早期基因（臺(tái)灣隔離群的26、242和418閱讀框）。這些基因獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，與寄主細(xì)胞從頭合成的病毒蛋白無(wú)關(guān)，在體外直接表達(dá)。這些即時(shí)早期基因在感染期間決定寄主范圍，調(diào)節(jié)反式作用因子。編碼DNA復(fù)制和核苷酸代謝所需的蛋白在病毒復(fù)制初期即開始了轉(zhuǎn)錄合成。初期轉(zhuǎn)錄的WSSV基因一般具有TATA框，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游具有20-30核苷酸。結(jié)構(gòu)蛋白是在感染后期合成的，一般有簡(jiǎn)并TIS基序（A/TNAC/G）），該序列位于富含A/T區(qū)下游25個(gè)堿基的位置，與節(jié)肢動(dòng)物的TIS基序相似。WSSV有一個(gè)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）元件，它能使以雙順?lè)醋有问綐?gòu)建的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）和綠色熒光蛋白（GFP）在體外同時(shí)有效地表達(dá)。第九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日泰國(guó)、中國(guó)大陸和臺(tái)灣WSSV隔離群的核苷酸序列有99.3%相同。WSSV基因組的不同區(qū)域表現(xiàn)出重要的序列變異。我國(guó)WSSV基因組有9.63kbp的不穩(wěn)定區(qū)，依寄主的不同發(fā)生了不同程度的缺失，使致毒力發(fā)生了變化。還有人認(rèn)為，不同WSSV隔離群的毒力和競(jìng)爭(zhēng)性適應(yīng)的差異取決于基因組的大?。夯蚪M最大的WSSV（312kbp）致毒力最低（半致死時(shí)間=12d），競(jìng)爭(zhēng)性適應(yīng)程度最小。這與生長(zhǎng)中觀察到的發(fā)病期對(duì)蝦的死亡率不同有關(guān)。

WSSV品系的遺傳性、抗原和毒力

第十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日WSSV的形態(tài)發(fā)生

(1)有感染性的WSSV,(2)有感染性的WSSV病毒體用具有細(xì)胞附著基元的膜蛋白附著到易感染細(xì)胞上，(3)WSSV進(jìn)入細(xì)胞，(4)WSSV的膜與內(nèi)體融合，裸露的核殼體用類似于桿狀病毒的方法轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，(5)裸露的WSSV核殼依附到核膜上，WSSV的基因組釋放進(jìn)細(xì)胞核中，(6)WSSV的基因組開始復(fù)制，線粒體開始退化，(7)在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)早期病毒發(fā)生基質(zhì)。它由稀疏的顆粒物質(zhì)組成。細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)積聚在核膜附近。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨大而活躍。(8)邊緣的染色質(zhì)變?yōu)闈饷艿沫h(huán)狀區(qū)（陰影部分）。病毒發(fā)生時(shí)基質(zhì)變淡，開始形成囊泡，囊泡會(huì)變成病毒膜。這些囊泡可能由環(huán)狀區(qū)的膜物質(zhì)構(gòu)成。病毒的核小體在病毒發(fā)生基質(zhì)中呈絲狀結(jié)構(gòu)。(9)在細(xì)胞核（電子密度高的內(nèi)含物）內(nèi)組裝成新的WSSV?？諝つ?nèi)充滿核殼。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器解體，細(xì)胞和細(xì)胞膜破裂。(10)形成完整的WSSV病毒體即將從破裂的細(xì)胞中釋放出來(lái)，開始感染新的細(xì)胞（新的循環(huán)）。第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日1期：細(xì)胞感染初期。被感染細(xì)胞的細(xì)胞核略膨大。病毒顆粒形成之前先出現(xiàn)病毒核小體。病毒顆粒由纖維狀的病毒蛋白形成。細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨大，具有大量游離核糖體。2期：細(xì)胞核內(nèi)的纖維物質(zhì)誘導(dǎo)形成環(huán)形膜，膜上很快就充滿了病毒核物質(zhì)，開始了病毒的組裝。此期在病毒發(fā)生基質(zhì)和高電子密度的邊緣染色質(zhì)之間的半透明區(qū)內(nèi)出現(xiàn)Cowdry-A型內(nèi)含物。細(xì)胞核膨脹呈圓形。第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日3期：在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)了核殼。核殼電子密度低，由一端向另一端生長(zhǎng)，初為開口。因具有大量病毒顆粒，中部核內(nèi)含物比第2期的細(xì)胞小，電子密度高。邊緣染色質(zhì)消失時(shí)，核膜破裂，邊緣透明區(qū)與發(fā)亮的細(xì)胞質(zhì)融合。大多數(shù)細(xì)胞器異常，分離，形成膜結(jié)構(gòu)。4期：細(xì)胞核內(nèi)的核殼形成致密的12-14圈球蛋白單位。每個(gè)核殼的一端圓、一端方，由膜完全包圍起來(lái)。第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日5期：病毒形成的后期。病毒顆粒呈卵形，可見(jiàn)到由膜衍生成的長(zhǎng)尾狀突起。尾內(nèi)物質(zhì)脫離核殼，之后因病毒內(nèi)有DNA-VP15復(fù)合物而變短，增厚，電子密度增加。6期：形態(tài)發(fā)生的最后階段。成熟的病毒體橢圓形，光滑的膜包圍高電子密度的核衣殼，在最后包被的一端有尾狀突出。有時(shí)組裝完的核殼與膜完全脫離，而褶皺。在這最后階段，感染的細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，隨著細(xì)胞解體，組織中出現(xiàn)一些空泡。第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日原位雜交表明，WSSV主要在斑節(jié)對(duì)蝦仔蝦胃角質(zhì)層下的皮下細(xì)胞和鰓皮下及肝胰臟細(xì)胞中復(fù)制；也有人認(rèn)為是在中腸干上皮細(xì)胞中復(fù)制。在24-26℃下，體長(zhǎng)2-3cm的日本對(duì)蝦人工感染W(wǎng)SSV后3d，各組織器官內(nèi)未觀察到明顯的病毒感染陽(yáng)性細(xì)胞；第4d首先在鰓絲腔內(nèi)的少量血細(xì)胞中觀察到病毒感染；第5d除血細(xì)胞外，同時(shí)在血竇鰓上皮組織、皮下組織內(nèi)觀察到；第6d在心臟、胃上皮組織內(nèi)觀察到；第7d在淋巴器官、中腸內(nèi)觀察到；第8d和第9d所有樣品上述組織器官中均為WSSV病毒陽(yáng)性。病毒從最初的復(fù)制部位擴(kuò)展到其他靶器官有二種途徑：螯蝦等是通過(guò)血細(xì)胞到達(dá)遠(yuǎn)處的靶器官；淡水蝦和對(duì)蝦等是通過(guò)游離血淋巴循環(huán)到達(dá)靶器官。PCR檢測(cè)表明，至少有18種養(yǎng)殖或野生對(duì)蝦、8種真蝦、7種龍蝦、7種螯蝦、38種蟹、6種非甲殼動(dòng)物、輪蟲和毛顎動(dòng)物及一些水生昆蟲幼蟲呈WSSV陽(yáng)性，多數(shù)為WSSV的機(jī)械攜帶者。第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日阻斷病毒感染的新途徑目前應(yīng)用研究的進(jìn)展：1.抗病轉(zhuǎn)基因育種：通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將某種基因?qū)胛r體，培育優(yōu)質(zhì)抗病對(duì)蝦新品種。

1）導(dǎo)入核酶基因，切斷核酸合成技術(shù)路線：2）導(dǎo)入包膜蛋白的反意RNA，阻斷翻譯包膜蛋白

3）導(dǎo)入新包膜蛋白基因，翻譯錯(cuò)誤的包膜蛋白例子：利用基因槍轉(zhuǎn)移以綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因作為報(bào)告基因的重組抗WSSV核酶基因的質(zhì)粒

pCDNA-RZI，成功得到轉(zhuǎn)GFP基因的中國(guó)對(duì)蝦。第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日阻斷病毒感染的新途徑2.基因工程藥物：原理：阻斷病毒與被感染細(xì)胞表面受體的結(jié)合，降低致病力；誘導(dǎo)產(chǎn)生“類免疫應(yīng)答”(quasi-immuneresponse)。例子：1）用大腸桿菌(Escherichiacoli)表達(dá)的重組

WSSV囊膜蛋白rVp28口服免疫斑節(jié)對(duì)蝦，7天浸溶攻毒免疫保護(hù)率達(dá)77%；

2）用大腸桿菌表達(dá)的重組WSSV囊膜蛋白rVp28和核衣殼蛋白rVp26肌肉注射免疫日本對(duì)蝦，30天注射攻毒免疫保護(hù)率達(dá)分別為95%和60%；

3)以家蠶核多角體病毒（BombyxmoriL.nuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV）表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的WSSV囊膜蛋白rVp28和rVp19口服免疫克氏原螯蝦，30天口服攻毒免疫保護(hù)率高達(dá)97%。第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日昆蟲桿狀病毒載體系統(tǒng)1.昆蟲桿狀病毒：它個(gè)體最大，能容許基因較大區(qū)域的缺失或替換，能容納大片段外源DNA的插入，增加外源基因表達(dá)的有效途徑。去除某些基因，如半光氨酸蛋白酶、組織蛋白酶、幾丁質(zhì)酶基因能增進(jìn)重組蛋白的穩(wěn)定性。2.桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)：是一種輔助性依賴（僅指粒載體不能表達(dá)外源基因）的真核DNA

表達(dá)載體；以昆蟲桿狀病毒，主要是家蠶核多角體病毒為外源基因載體，以昆蟲或其細(xì)胞為受體的表達(dá)系統(tǒng)。第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日家蠶（BombyxmoriL.nuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV）表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)預(yù)防WSSV蛋白特點(diǎn)：家蠶具開放式血管系統(tǒng)，纖薄而強(qiáng)韌的表皮層包圍著充滿血淋巴及各種器官的空間，是個(gè)微妙的高效“發(fā)酵罐”；產(chǎn)物能糖基化、磷酸化、酰胺化等各種修飾作用。程序：1)目的基因克隆進(jìn)桿狀病毒載體質(zhì)粒內(nèi)；2）與野生型病毒基因組一起共轉(zhuǎn)染蠶體細(xì)胞；3）檢測(cè)出表達(dá)的抗原性蛋白；4）用于實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦。第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)用前景：變“夕陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”為“朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”

用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒