第二章酶工程2-酶的生產(chǎn)和分離純化

第二章酶工程

——酶的生產(chǎn)和分離純化Contentsofchapter2二、酶的提取與分離純化技術(shù)路線三、細(xì)胞破碎四、酶的提取五、酶的分離方法六、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶一、酶的生產(chǎn)1.對酶源的要求2.微生物作為酶的優(yōu)勢3.對酶生產(chǎn)菌的要求一、酶的生產(chǎn)動植物、微生物生物合成化學(xué)合成1.對酶源的要求1）酶含量豐富2）提取、純化方便一、酶的生產(chǎn)2.微生物作為酶的優(yōu)勢1）微生物種類多，易得到所需的酶類2）可以控制微生物培養(yǎng)條件，易獲得高產(chǎn)菌株3）生產(chǎn)成本低4）微生物繁殖快、生長周期短5）生產(chǎn)易管理6）提高微生物產(chǎn)酶能力的途徑較多7）微生物易改造，可提高酶產(chǎn)量或改造酶一、酶的生產(chǎn)3.對酶生產(chǎn)菌的要求1）不是致病菌，也不產(chǎn)毒素2）不易變異退化，不易感染噬菌體3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶4）原料廉價，周期短，易培養(yǎng)一、酶的生產(chǎn)主要產(chǎn)酶菌：大腸桿菌：應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌，一般分泌胞內(nèi)酶。因為其遺傳背景清楚而廣泛應(yīng)用于遺傳工程改造微生物的宿主，被改造成表達(dá)優(yōu)良性狀的“工程菌”。也常在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、門冬氨酸酶、限制性核酸內(nèi)切酶等?？莶輻U菌：工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶等的產(chǎn)酶菌。啤酒酵母：工業(yè)上廣泛應(yīng)用，主要產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等。曲酶（黑曲酶和黃曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果膠酶、氨基?；?、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基?；浮⒅久傅榷喾N酶。細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。二、酶的提取與分離純化技術(shù)路線酶的純化過程，約可分為三個階段：(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein):采樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質(zhì)酶(homogeneous):目標(biāo)酶的進一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機三、細(xì)胞破碎機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷帷⑾A、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。四、酶的提取提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。四、酶的提取提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。四、酶的提取五、酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go1、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離1、沉淀分離沉淀分離方法分離原理有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。

在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為β分段鹽析。鹽析在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。鹽析影響蛋白質(zhì)鹽析沉淀的因素a.蛋白質(zhì)的濃度:2.5-3.0%b.介質(zhì)的pH:接近等電點c.溫度:一般在室溫，特殊在4度d.鹽類型:單價鹽很差1、沉淀分離鹽析

空間排阻學(xué)說：PEG分子在溶液中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與溶液中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生空間排擠作用，從而使蛋白質(zhì)分子凝聚而沉淀下來。1、沉淀分離PEG沉淀影響因素

a.蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量——大，沉降好b.蛋白質(zhì)濃度:濃度高，易于沉淀；太高，分段作用減弱c.pH值:接近等電點d.離子強度:低離子強度影響不大，過高影響分段效果

e.溫度:0－30度f.PEG聚合度:越高，用量越少；過高操作不便，多用PEG60001、沉淀分離PEG沉淀有機溶劑之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等有機溶劑等電點沉淀法

蛋白質(zhì)在等電點（ｐI）處，凈電荷為0，易于沉淀。熱變性沉淀法

可用其他輔助因子、底物等方法，使目的酶的熱變性溫度提高。1、沉淀分離離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。2、離心分離低速離心機,其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，在酶的分離中主要用于沉淀細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。2、離心分離區(qū)帶離心法等密度平衡離心法高速離心法的比較蛋白質(zhì)分子在離心時，其分子量、分子密度、組成、形狀等，均會影響其沉降速率，沉降系數(shù)即用來描述此沉降性質(zhì)；其單位為

S(Svedbergunit)。

每一種的沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法分離。2、離心分離3、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴散膜分離透析4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)層析方法分離依據(jù)離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠過濾層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化4、層析分離離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換層析按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠過濾層析凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。常用的凝膠：

葡聚糖凝膠

瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。親和層析酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.親和層析根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：

共價親和層析 疏水層析 金屬離子親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析

5、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。5、電泳分離顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。5、電泳分離聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）加入1%~2%的SDS制備而成。SDS－PAGE主要用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量?；驹恚篠DS－蛋白質(zhì)復(fù)合物中SDS含有大量陰離子，從而掩蓋了蛋白質(zhì)之間原來的電荷的差異；而且蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變變成橢圓形，短軸為18埃左右，長軸與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量成正比－－－SDS－蛋白質(zhì)