實驗八親和層析分離純化蛋白質(zhì)

實驗八親和層析分離純化蛋白質(zhì)第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日

實驗目的掌握GST親和層析分離純化目標蛋白的原理和實驗方法（第一部分）掌握SDS檢測目標蛋白原理和方法（第二部分）第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日第一部分

GST親和層析分離純化目標蛋白第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日

一、實驗原理第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日親和層析

生物大分子與配體特異非共價可逆結合。酶-底物或底物類似物抗體-抗原激素-受體外源凝集素-多糖、糖蛋白、細胞表面受體核酸-互補核苷酸序列（Oligo-dT）第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日親和層析原理第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日GST親合層析谷胱甘肽硫轉移酶（GST，26kd，與谷胱甘肽GSH特異結合）GSH作為配體，共價結合在葡聚糖上，（Sepharose4B）GST融合目標蛋白葡聚糖上的GSH與GST融合蛋白結合用還原型GSH洗脫GST融合蛋白第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日GSH-Sepharose4B第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日GSH-Sepharose4B第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日外源蛋白的表達和純化第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日

二、實驗步驟第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日

（一）目標蛋白誘導表達和菌體收集

1．0.5mmol/LIPTG誘導大腸桿菌中的蛋白表達，28℃，200rpm培養(yǎng)3-6h。2．5000rpm離心5min，倒掉上清。3．沉淀加40ml水，5000rpm離心5min。第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日（二）細胞破碎1．倒掉上清，加30mlPBS緩沖液懸浮菌體。2．破碎菌體，超聲波2min，停止1min。（菌液始終保持在冰浴中）3．重復8-10遍，直至菌液清澈。第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日（三）離心

1．每個小組分取1-2ml細胞破碎液，

12000rpm，離心5min。2．分取50uL上清液，4℃保存。3．其余的上清液準備過GST柱子。第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日（四）裝GST柱子1．清洗和裝好層析柱，封閉出口。2．加入2mLPBS。3．用滴管取0.5-1mlGST填料，加入柱子中。4．打開柱子出口，使PBS緩慢流出。注意：始終保持柱內(nèi)的液面高于GST樹脂。第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日（五）純化目的蛋白1．用5mlPBS緩沖液洗柱床，重復3遍。2．將混合蛋白質(zhì)溶液加到柱子中。3．用5mlPBS緩沖液洗柱子，重復3遍。4．加入1ml洗脫液。第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日5．用離心管收集洗脫液，每管收集0.2ml。6．PBS緩沖液洗柱子3遍，關閉出口。7．用分光光度計測定每一管的吸光度值，記錄讀數(shù)，繪制洗脫曲線。8．將讀數(shù)最大的一管用于SDS分析。第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日第二部分

SDS檢測目標蛋白第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日

一、實驗原理第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)與SDS按1：1.4比例形成復合物，消除了蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)的遷移速度只取決于分子大小。在15-200KD之間，遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系：logMW=K-bm第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日濃縮膠濃縮膠pH6.8，GlypI6.0，三類離子在電場中的遷移速度：Cl->蛋白質(zhì)>Gly-。電泳時，Cl-快，Gly-慢，在快慢離子間形成了一個低離子濃度的高壓區(qū)，區(qū)內(nèi)的蛋白質(zhì)加速移動。當?shù)鞍踪|(zhì)移到Cl-區(qū)時，高電壓消失，蛋白質(zhì)的移動速度減慢，在快慢離子間被濃縮。第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、實驗步驟1．洗凈玻璃板，用蒸餾水沖洗干凈后吹干，安裝制膠器。2．根據(jù)下列配方制作12%分離膠。

第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日12%分離膠試劑名稱12%分離膠蒸餾水2.5ml30%丙烯酰胺（29:1）3.0ml1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0ml10%SDS75ul四甲基乙二銨（TEMED）10ul10%過硫酸銨（AP）75ul總體積7.5ml第二十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日按上表中所列順序加試劑，加完AP后輕輕搖勻，迅速加入兩塊玻璃板間。在分離膠液面上緩慢滴加1mL蒸餾水，聚合15min，至分離膠與水之間出現(xiàn)一條清亮的分界線，倒掉水層，用濾紙條吸干殘余的水。第二十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日試劑名稱5.0%蒸餾水1.7ml30%丙烯酰胺（29:1）430ul1MTris-HCl（pH6.8）310ul10%SDS25ul四甲基乙二銨（TEMED）10ul10%過硫酸銨（AP）25ul總體積2.5ml3．制作5.0%濃縮膠按照下表配好濃縮膠，輕輕混勻，灌膠2ml，插入梳子，聚合15min。第二十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日4．把膠板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，拔掉梳子，電極緩沖液應該完全沒過電極。5．每個點樣孔加30ul樣品，每板膠加10ulMarker。6．50V電泳20min，等蛋白進入分離膠后，將電壓調(diào)節(jié)到80V，電泳2-3h。7．