臨床檢測(cè)樣本RNA提取方法的比較研究分析 生物技術(shù)專業(yè)

臨床檢測(cè)樣本RNA提取方法的比較研究（asonPusolPus和OTAA（DHARNAQueasyDNA/RNAPRV（CSV（JV三種RNAReal-timePCRRNAQueasyDNA/RNARNA病毒檢測(cè)以及定性分析。對(duì)于Real-timeDNA/RNACTPlusTrollPlusRNA關(guān)鍵詞：RNA；提取方法；比較；臨床ComparisonofMethodsofclinicaltestsamplesRNAextractionAbstract：Threecommerciallyavailablecellsates(LiaisonPlus,TrollPlusandRNAOUT)andtwoDNA/RNAco-kits(ALCMENAdouble-kit,QueasyrapidDNA/RNAco-kit)wereselectedto extractthreeanimalRNACSFVandJEV）.TheRNAqualitywasevaluatedindirectlybyagaricgelelectroplateandReal-timePCR.Theresultshows,foragaricgelelectroplate,theclearlyandhighlightbandscanbeseenabovethegroupsofthethreecellsatesandQueasyrapidDNA/RNAco-kit,whichcanbeusedforclinicalRNAvirusdetectionandqualitativeanalysis.ForReal-timePCR,theCTvalueoftheQueasyrapidDNA/RNAco-kitgroupisthelowest,andthetwocellsatesgroups(LiaisonPlus,TrollPlus)followed.TheabovethreereagentscanbeusedforclinicalRNAvirusdetectionandquantitativeanalysis.Keywords:RNA；ExtractionMethod；Comparison；ClinicalRNA是生物體重要的遺傳物質(zhì)[1]2002Science10大科學(xué)成就中RNA名列榜首。RNA分子提取是生物學(xué)研究中的一項(xiàng)基本內(nèi)容，是進(jìn)行基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)[2]DNAPCRNorthern雜交等下游分子RNA[3]。RNARNARNARNARNA實(shí)驗(yàn)RNARNA對(duì)于分子克隆和基因表達(dá)分析等試驗(yàn)是至關(guān)重要的[4,5]ChomskySacchiRNA[6]，RNARNA提取方法有強(qiáng)變性劑法[7]、法[8]ADS-Phenol法[9]以及熱硼酸法[10]RNA公司的LiaisonPlus；InvitingTripoliRNAPureLinkRNAMiniKit；上UNlQ-10TripoliRNARNA小量teriaRNAkit以及高純RNA（HPtotlRNAkitEngageRNeasyProtectBacteriaMiniandMidiKitsRNA。PCR[11,12]（供體分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時(shí)，供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)CtPCRC（CltThsholdCtPCR產(chǎn)物的數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，只要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行“實(shí)時(shí)”檢測(cè)并獲得未知樣品的Ct值，即PCRPCRPCR反應(yīng)過(guò)程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，PCRDNA（熒光探針RNA的方法很多，但是其基本都是把細(xì)胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)為目標(biāo)。而且材料自身物理化學(xué)性質(zhì)的不同，不同的材料需要不同的提取方法［19,0。因此，需要通過(guò)對(duì)比RNA提取方法。材料與方法試劑（JXA1-R（成都天邦生物制品有限公司日本乙型腦炎弱毒活疫苗SA1142株TrollPlusRNA（南京天為生物科技有限公司，RNO（北京天恩澤基因科技有限公司LiisonPlu（寶生物工程有限公司，柱式病毒D雙提試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司，QaDA/RNA共提試劑盒（上?？祆`生物科技有限公司，氯仿（乙醇，異丙醇（上海申博化工有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（，Mixtur（）RNA提取RNA(1)LiaisonPlus法100μd2O500u700μL5min；12000rpm/min，45min600μL上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-2030min以上；12000rpm/min15min，棄上清；加入400μL，75%的乙醇，顛倒4次；12000rpm/min離心5min，棄上清；12000rpm/min30—40μLReleasefreedH2O，-80℃保存?zhèn)溆?。其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、SVJERNAOUT法100μd2O500u700μL5min；12000rpm/min，45min600μL上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-2030min以上；12000rpm/min15min，棄上清；加入400μL，75%的乙醇，顛倒4次；12000rpm/min離心5min，棄上清；12000rpm/min30—40μLReleasefreedH2O，-80℃保存?zhèn)溆?。其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、SVJETrollPlus法100μd2O500u700μL5min；12000rpm/min，45min600μL上清，加入等體積的異丙醇，沉淀RNA，緩慢搖勻；-2030min以上；12000rpm/min15min，棄上清；加入400μL，75%的乙醇，顛倒4次；12000rpm/min離心5min，棄上清；12000rpm/min30—40μLReleasefreedH2O，-80℃保存?zhèn)溆?。其中，疫苗稀釋液有三種（PRRSV、SVJEDHARNARNA1.5mL100μL600μLA30s混勻A465℃水500μL溶液轉(zhuǎn)移到離2min12000rpm1min2min；12000rpm700μL的通用洗柱液到離心吸附柱中，12000rpm室溫1min12000rpm室溫離1mi（干甩Freebase1.5mL30—40μL的洗脫2min；12000rpmRNA（PRRSV、SVJEQueasyDNA/RNARNA1.5mL100μL300μL2—3min400μL12000rpm5min，600μL50%600μL75%乙醇，振蕩混勻，12000rpm1min，棄凈溶液；離心管短暫5—10s10μL10—30uL洗脫液，振蕩混勻后短暫離心，置于-80℃保存?zhèn)溆?。（PRRSV、SVJE1.3RNA質(zhì)量檢測(cè)1.3.1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA6μLReactionMix（4X）2μL，混勻后室溫放置2miACrtRationShoppr52μ5XAllineTmter4μ，AntinuclearH2O20μL8℃5minNPCRRNA—5L1.085V25minRNA樣品有三種（PRRSV、SVJE1.3.2Real-timePCRRNA6μLReactionMix（4X）2μL，混勻后室溫放置2miACrtRationShoppr52μ5XAllineTmter4μ，AntinuclearH2O20μL℃8℃5min。RNA樣品有三種（PRRSV、SVJEReal-timePCR體系，如下：體系： SYRPrmixEXⅡ（2x：10ALPCRForwardPrimer： 0.6ALPCRReversePrimer： 0.6ALDNA模板 2AL三蒸水 6.8AL20AL兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：Stage1：預(yù)變性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反應(yīng)Reps：4095℃5秒60℃30秒Real-timePCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，按照內(nèi)參基因和目的基2ΔΔCTCTABI7300PCR（AppliedBiosystems公司進(jìn)行。其中，每組試驗(yàn)設(shè)立三個(gè)重復(fù)。2.結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R株）檢測(cè)結(jié)果從圖1可以看出，LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus和Queasy快速DNA/RNADHARNA圖1PRRSVDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（M為Marker，0為空白對(duì)照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15分別為3個(gè)平行組，依次對(duì)應(yīng)LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus、柱式病毒DHARNA雙提試劑盒、Queasy快速DNA/RNA共提試劑盒）豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗檢測(cè)結(jié)果從圖2可以看出，LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus和Queasy快速DNA/RNA快速DNA/RNA共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高；LiaisonPlus和RNAOUT對(duì)應(yīng)的組條帶中度清晰、亮度中等，但兩組之間無(wú)肉眼可見(jiàn)差距；TrollPlus對(duì)應(yīng)的組清晰度較低，亮度低；柱式病毒DHARNA雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。圖2CSFVDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（M為Marker，0為空白對(duì)照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15分別為3個(gè)平行組，依次對(duì)應(yīng)LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus、柱式病毒DHARNA雙提試劑盒、Queasy快速DNA/RNA共提試劑盒）日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測(cè)結(jié)果從圖3可以看出，LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus和Queasy快速DNA/RNA共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組之間，電泳條帶亮度和清晰度很高。其中，QueasyDNA/RNA共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高；LiaisonPlusRNAOUTPlusDHARNA雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組未發(fā)現(xiàn)條帶，表現(xiàn)不理想。圖3JEVDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（M為Marker，0為空白對(duì)照，1-3、4-6、7-9、10-12、13-15分別為3個(gè)平行組，依次對(duì)應(yīng)LiaisonPlus、RNAOUT、TrollPlus、柱式病毒DHARNA雙提試劑盒、Queasy快速DNA/RNA共提試劑盒）Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果高致病性豬繁殖于呼吸綜合癥活疫苗（JXA1-R株）檢測(cè)結(jié)果4可以看出，LiaisonPlusRNAOUT、TrollPlusDHARNAQueasyDNA/RNACT值均較低。其中，QueasyDNA/RNACT值最低；LiaisonPlus和RNAOUTCTPlusCTDHARNACT值最高。圖4PRRSVReal-timePCR檢測(cè)結(jié)果LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusDHARNA雙提試劑盒、QueasyDNA/RNA共提試劑盒）豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗檢測(cè)結(jié)果5可以看出，LiaisonPlusRNAOUT、TrollPlusDHARNAQueasyDNA/RNACT值均較低。其中，QueasyDNA/RNACT值最低；LiaisonPlus和RNAOUTCT值其次，但兩組間差距不明顯；TrollPlus和柱式病毒DHARNA雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組CT值稍最高，但兩組間差距不明顯。圖5CSFVReal-timePCR檢測(cè)結(jié)果LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusDHARNA雙提試劑盒、QueasyDNA/RNA共提試劑盒）日本乙型腦炎弱毒活疫苗檢測(cè)結(jié)果6可以看出，LiaisonPlusRNAOUT、TrollPlusDHARNAQueasyDNA/RNACT值均較低。其中，QueasyDNA/RNACT值最低；LiaisonPlus和RNAOUTCTPlusCT值稍高；柱式病毒DHARNA雙提試劑盒對(duì)應(yīng)的組CT值最高。圖6JEVReal-timePCR檢測(cè)結(jié)果LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusDHARNA雙提試劑盒、QueasyDNA/RNA共提試劑盒）討論RNA的提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)[21]RNA更是科研研究和病原診斷的關(guān)鍵。只有獲得高純度、高濃度和完整性好RNADNAPCR、Northern雜交等下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。RNA的提取關(guān)鍵在于組織細(xì)胞裂解。組織裂解方法有很多，包括胍鹽裂解法、[22]。LiaisonPlusTrollRNAOUTRNA通常情況下，分子生物學(xué)試驗(yàn)只需單獨(dú)提取一種類型的核酸（DNA/RNA）或蛋DNARNADHARNA雙提試劑盒法、快靈生物科技有限公司QueasyDNA/RNADNARNA，毒性小，且獲得的核酸完整性好，純度高等。筆者所在實(shí)驗(yàn)室選取了市售的三種細(xì)胞裂解液（LiaisonPlus、TrollPlus和RNAOUT）DNA\RNA共提試劑盒（DHARNA雙提試劑盒、Qa快速DNA/RNA共提試劑盒（PRRSV、RNARNAPCR并進(jìn)行瓊脂糖凝Real-timePCRPCRCTRNA質(zhì)量作評(píng)價(jià)和比較。PRRSV，LiaisonPlusRNAOUTTrollPlusQueasyDNA/RNADNARNA質(zhì)量好。因此，上述試劑可用于臨床PRRSV的病毒檢測(cè)以及定性分析。對(duì)于CSFV，Queasy快速DNA/RNALiaisonPlusRNAOUT，TrollPlusCSFV的病毒檢測(cè)以及定性分QueasyDNA/RNALiaisonPlusRNAOUTJEV，QueasyDNA/RNA共提試劑盒所對(duì)應(yīng)的組條帶最清晰、亮度最高，LiaisonPlusRNAOUT，TrollPlusJEV的病QueasyDNA/RNA共提試劑盒、LiaisonPlusRNAOUT。Real-timePCRPRRSV，QueasyDNA/RNA共提試劑盒對(duì)CTDNARNALiaisonPlusRNAOUTDHARNA雙提試劑盒TrollPlusPRRSVQueasyDNA/RNALiaisonPlus和RNAOUTCSFV，Queasy快速DNA/RNA共提試劑盒對(duì)應(yīng)的組CT值最低，表明對(duì)應(yīng)的DNA濃度和純度最好，間接說(shuō)明所提取的RNA質(zhì)量最好。其次是LiaisonPlus和RNAOUTDHARNATrollPlus表現(xiàn)不理想。因此，CSFVQueasyDNA/RNA共提試劑盒、LiaisonPlusRNAOUTJEV，QueasyDNA/RNA共提試劑CTDNARNALiaisonPlusRNAOUTDHARNA雙提試TrollPlusJEV的病毒檢測(cè)以及定量分QueasyDNA/RNA共提試劑盒、LiaisonPlusRNAOUT。PRRSV，CSFVJEVRNARNA進(jìn)行提取RNA病毒，具有代表性。通過(guò)比較分析實(shí)JEVRNA病毒進(jìn)行檢測(cè)QueasyDNA/RNALiaisonPlusRNAOUT兩RNA質(zhì)量好，利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，市面上已經(jīng)出現(xiàn)自動(dòng)核酸提取儀，如ABI公司的ABIPRISMTM610096個(gè)樣品的純化工作，并且可RNADNA[23]96個(gè)樣本，因此多數(shù)高校和科研機(jī)構(gòu)并未普及。RNARNA提取方法應(yīng)根據(jù)RNA提取的方法會(huì)越來(lái)越簡(jiǎn)便、快速、高效。參考文獻(xiàn)：JunHChanHAsimplerapidandeffectivemethodfortotalRNAextractionfromTendentiousness[J].Biotechnology,2006,28:Brooks，Joseph，EdwardFKitsch，ThomasMannerist．MolecularCloning．ColdspringharborlaboratorypressNewYork，1989，2．[3]RNA[J]30(16):20-22．[4]王桂玲，黃東陽(yáng)，劉戈飛.一種從動(dòng)物組織中提取高質(zhì)量總RNA的方法[J].生命科學(xué)研究,2003,03:275-278.[5]王桂玲，劉戈飛，黃東陽(yáng).從動(dòng)物組織提取高質(zhì)量總RNA方法的改進(jìn)[J].生物技術(shù)通訊,2003,06:512-514.[6]ChomskySacchiN.SinglestepmethodofRNAisolationbyacidtheatre-in-the-roundphenol-chloroformextraction[J].Biochemist,1987,162:156-159[7]陳暉,何海福.植物組織總RNA提取方法的研究進(jìn)展[J].甘肅農(nóng)業(yè),2006,8:228-230ChenH,HeHProgressofExtractionMethodsforPlantTissuesRNA[J].JournalofGinsuAgriculture,2006,8:228-230[8]楊占軍,谷守琴,張健.幾種植物組織總RNA提取方法的特點(diǎn)及疑難對(duì)策[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(18):8341-8342YangZJ,GSQ,BhangJ.CharacteristicsofSeveralExtractionMethodsonTotalRNAinPlantTissuesandStrategiestoProblems[J].JournalofInhumanAgniSci,2009,37(18):8341-8342[9]吳麗娟,黎燕,胡美茹,等.改進(jìn)ADS-Phenol法快速提取細(xì)胞總RNA[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,1(21):57-59WuLJ,LiY,HMR,ETAL.PreparationofcellulartotalRNAbyimprovedADS-phenolmethod[J].ActaAcademeMedicMilitantsInertial,1999,1(21),57-59姚玉新趙玲玲郝玉金RNA[J果樹(shù)學(xué)報(bào),2005,22(6):737-740FaoYX,Chaos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