生物技術制藥-第七章 發(fā)酵工程技術

第二章

發(fā)酵工程制藥

第一節(jié)概述一、發(fā)酵工程 微生物工程:利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供技術服務的技術。涉及到生命體的繁殖、生長、生產(chǎn)、衰老等過程，實質上是一個非常復雜的自催化過程。發(fā)酵工程是生物技術的基礎，其他技術如基因工程、細胞工程、酶工程等都與發(fā)酵工程密切相關。發(fā)酵中的化學反應是通過微生物完整細胞的綜合生物化學過程實現(xiàn)，在發(fā)酵工業(yè)中，要求微生物細胞既能正常生長，又能過量積累目的產(chǎn)物。現(xiàn)代的發(fā)酵工業(yè)已形成完整的體系，包括抗生素、氨基酸、維生素、有機酸、多糖、酶制劑、單細胞蛋白、基因工程藥物、核算類物質及其他生物活性物質的生產(chǎn)。(一)發(fā)酵的定義1、傳統(tǒng)發(fā)酵

最初發(fā)酵是用來描述酵母菌作用于果汁或麥芽汁產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，或者是指酒的生產(chǎn)過程。2、生化和生理學意義的發(fā)酵指微生物在無氧條件下，分解各種有機物質產(chǎn)生能量的一種方式，或者更嚴格地說，發(fā)酵是以有機物作為電子受體的氧化還原產(chǎn)能反應。如葡萄糖在無氧條件下被微生物利用產(chǎn)生酒精并放出CO2。3、工業(yè)上的發(fā)酵

泛指利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程,包括：1.厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。2.通氣（有氧）培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如抗生素、氨基酸、酶制劑等。產(chǎn)品有細胞代謝產(chǎn)物，也包括菌體細胞、酶等。(二)發(fā)酵工業(yè)定義：是指利用生物的生命活動產(chǎn)生的酶，無機或有機原料進行酶加工，獲得產(chǎn)品的工業(yè)。發(fā)酵食品有機酸氨基酸核酸類物質酶制劑醫(yī)藥工業(yè)（抗生素…）飼料工業(yè)（單細胞蛋白環(huán)境工程（廢物處理）其它（冶金工業(yè)…）抗生素、生物制藥、氨基酸、核苷酸、有機酸、飼料添加劑、微生態(tài)制劑、生物農(nóng)藥、生物肥料等(1)傳統(tǒng)生物技術(2)現(xiàn)代生物技術基因工程菌發(fā)酵二、發(fā)酵類型

1、微生物菌體發(fā)酵定義：是以獲得具有多種用途的微生物菌體細胞為目的的產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)，包括單細胞的酵母和藻類、擔子菌，生物防治的蘇云金桿菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。藥用微生物制劑等。特點：細胞的生長與產(chǎn)物積累成平行關系，生長速率最大時期也是產(chǎn)物合成速率最高階段，生長穩(wěn)定期產(chǎn)量最高。2、微生物的酶目前的酶多數(shù)來源于微生物發(fā)酵醫(yī)用酶制劑的生產(chǎn)醫(yī)藥工業(yè)用酶酶的特點：易于工業(yè)化生產(chǎn)，便于改善工藝提高產(chǎn)量。生物合成特點：需要誘導作用，或遭受阻遏、抑制等調控作用的影響，在菌種選育、培養(yǎng)基配制以及發(fā)酵條件等方面需給予注意。3、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵包括初級代謝產(chǎn)物、中間代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。對數(shù)生長期形成的產(chǎn)物是細胞自身生長所必需的，稱為初級代謝產(chǎn)物或中間代謝產(chǎn)物。各種次級代謝產(chǎn)物都是在微生物生長緩慢或停止生長時期即穩(wěn)定期所產(chǎn)生的，來自于中間代謝產(chǎn)物和初級代謝產(chǎn)物。1,3-丙二醇兩步發(fā)酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎桿菌、丁酸梭菌等4、微生物的生物轉化定義：是利用生物細胞對一些化合物某一特定部位（基團）的作用，使它轉變成結構相類似但具有更多經(jīng)濟價值的化合物。最終產(chǎn)物是由微生物細胞的酶或酶系對底物某一特定部位進行化學反應而形成的。三、微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類（一）抗生素類9000種微生物發(fā)酵占70％。有價值的抗生素，幾乎全部由微生物生產(chǎn)抗細菌，病毒，真菌，腫瘤，原蟲，寄生蟲等（二）氨基酸類單個氨基酸制劑：復方氨基酸制劑：

微生物發(fā)酵法：酶轉化法黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑（三）核苷酸類肌苷酸，肌苷，AMP，ATP，輔酶等（四）維生素類維生素C的原料藥2-酮基-古龍酸，維生素A的前體B-類胡蘿卜素，維生素D2的前體麥角甾醇，維生素B2，B12等（四）甾體類激素甾體類激素的生產(chǎn)過程中，一些特異反應需借助微生物的反應。（五）治療酶及酶抑制劑藥用酶酶抑制劑四、發(fā)酵工程制藥特點及發(fā)展趨勢（1）菌種是根本（2）理論產(chǎn)量存在“生物學變量”（3）常溫常壓下反應，安全，條件簡單（4）純種培養(yǎng)，防污染（5）可制備復雜高分子化合物（6）分子水平，定向發(fā)酵，組合生物合成等（7）發(fā)酵工業(yè)成本低菌種選育自然界選種、誘變育種、基因工程、細胞工程培養(yǎng)基配制根據(jù)培養(yǎng)基的配制原則制備，實踐中需多次試驗配方滅菌殺滅雜菌（胞體、孢子及芽孢）擴大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過程（中心階段）檢測進程，滿足營養(yǎng)需要；嚴格控制溫度、pH、溶氧、轉速等分離純化菌體：過濾、沉淀；代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換發(fā)酵工程基本流程發(fā)酵的基本過程發(fā)酵的基本過程:菌種種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預處理提取精制菌種菌種的性能質量，包括菌種的生產(chǎn)能力、生長繁殖情況和代謝特性決定了發(fā)酵水平的高低。要求：產(chǎn)量高、生長快、性能穩(wěn)定、容易培養(yǎng)。保藏：休眠狀態(tài)保存在冷凍干燥管中，放于0~4度恒溫冰箱內。臨時取出接種后仍需冷藏。使用期：砂土管中為1~2年菌種應不斷純化，淘汰變異菌落，防止衰退。種子制備使菌種繁殖，以獲得足夠數(shù)量的菌體，以便接種到發(fā)酵罐中。發(fā)酵使微生物產(chǎn)生大量的目的產(chǎn)物，是發(fā)酵的關鍵階段。產(chǎn)物提取發(fā)酵液是一種混合物，提取過程包括：①發(fā)酵液的預處理和過濾；②提??；③精制典型發(fā)酵過程發(fā)酵工程的發(fā)展現(xiàn)代意義上的發(fā)酵工程是一個由多學科交叉、融合而形成的技術性和應用性較強的開放性的學科。“農(nóng)產(chǎn)手工加工——近代發(fā)酵工程——現(xiàn)代發(fā)酵工程”。發(fā)酵工程的發(fā)展第一階段：利用傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)葡萄酒、酒、醋、醬、奶酪等食品。憑借經(jīng)驗、探索本質巴斯德為發(fā)酵工程提供了理論基礎，被譽為生物工程之父。第二階段：1900-1940，新的發(fā)酵產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，主要有酵母、甘油、乳酸、檸檬酸、丁醇和丙酮等。梭菌引起丙酮、丁醇發(fā)酵，服務于戰(zhàn)爭的彈藥制造。丁醇的制備時第一個進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵過程，也是工業(yè)生產(chǎn)中首次采用大量純培養(yǎng)技術的工藝，而這一個工藝成功的重要因素是：排除了培養(yǎng)體系中其他有害微生物，在該時期是相當先進的生物技術。第三階段：發(fā)酵工業(yè)大發(fā)展時期，青霉素工業(yè)化成功地推動了發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。主要標志有：深層培養(yǎng)、生產(chǎn)大規(guī)?；?，多種抗生素、氨基酸、核酸發(fā)酵成功，甾體的微生物轉化等。該階段采用純種發(fā)酵，進行無菌操作，對操作條件有嚴格的控制，相應地采用較復雜的工藝和設備。1929年，F(xiàn)leming發(fā)現(xiàn)青霉素，但當時無法提取精制。第二次世界大戰(zhàn)促使實現(xiàn)了青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。1942年，以青霉素工業(yè)生產(chǎn)為標志深層通氣培養(yǎng)法的建立標示了發(fā)酵工程發(fā)展的一次新飛躍。預示著發(fā)酵工程從厭氧發(fā)酵為主的工藝躍入深層通氣發(fā)酵為主的工藝，該工藝的區(qū)別不僅僅是通氣，更是與此相適應的一整套工程技術，如大量滅菌空氣的制備、中間無菌取樣技術、大罐無菌操作和管理技術、產(chǎn)品分離提純技術、設備的設計技術等。1944年，第二個抗生素鏈霉素誕生第四階段，基因工程等高新技術應用階段。提出DNA雙螺旋模型發(fā)現(xiàn)細胞中的“質?！笔悄茉诩毦旧w外進行自我繁殖的細胞質因子（基因操作起點）DNA限制酶和連接酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)酵工程的研究內容菌種的培養(yǎng)和選育、菌的代謝與調節(jié)、培養(yǎng)基滅菌、通氣攪拌、發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵過程各種參數(shù)與動力學、發(fā)酵反應器的設計與自動控制、產(chǎn)品的分離純化和精制發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)水平取決于三個要素：生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和發(fā)酵設備。第二節(jié)、發(fā)酵工程中的微生物一、常見的藥用微生物發(fā)酵工程所利用的微生物主要是細菌、放線菌，酵母菌和霉菌細菌放線菌（一）細菌主要生產(chǎn)氨基酸，核苷酸，維生素等（二）放線菌產(chǎn)抗生素最多的一類微生物另外生產(chǎn)B12,酶，甾體轉化抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進行復雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：放線菌（鏈霉素；四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細菌植物或動物來源鏈霉菌（三）真菌抗生素維生素酶制劑有機酸等藥用真菌（大型真菌）1.藻狀菌綱：根霉；犁頭霉2.子囊菌綱：酵母3.擔子菌綱：牛肝菌，靈芝4.半知菌綱：曲霉；青霉；頭孢酶二、生產(chǎn)菌種的選育工業(yè)化菌種的要求1.遺傳性能要相對穩(wěn)定2.生長速度快，不易感染它種微生物或噬菌體3.目標產(chǎn)物產(chǎn)量接近理論轉化值4.目標產(chǎn)物分泌到胞外5.盡可能減少類似物產(chǎn)量6.能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物優(yōu)良菌種是發(fā)酵工程產(chǎn)品開發(fā)的關鍵。自然界中分離的野生型菌種在產(chǎn)量和質量上都不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，必須通過人工培育。優(yōu)良菌種的選育不僅為發(fā)酵工業(yè)提供高產(chǎn)菌株，還可以提供各種類型的突變菌株。菌種選育的物質基礎遺傳物質支配著各種酶在生物體內有條不紊的行使其功能。DNA分子結構的改變時誘變育種的工作基礎，染色體搭配的變化交換是雜交育種的根據(jù)。對DNA分子結構和它復制過程的了解江有利于充實誘變育種的理論根據(jù)你。質粒也是遺傳物質，是染色體外的遺傳結構，能在細胞中進行自主復制，并能離開染色體單獨存在。許多質粒攜帶一些能影響宿主細胞類型的基因。菌種選育包括自然選育、誘變選育、雜交選育等經(jīng)驗育種方法，同時包括控制雜交育種、原生質體融合、基因工程等定向育種方法。自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。（1）自然選育利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程自然選育就是將正突變菌株挑選出來，進行擴大培養(yǎng)。該方法可以達到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)水平、提高產(chǎn)物產(chǎn)量的目的，但是效率低、進展慢。1采樣2.分離菌株自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。平板分離(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗單細胞(孢子)懸液的制備挑選單菌落禮來公司花了10年的時間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。（2)自發(fā)突變與定向育種一定情況下，長期處理微生物并移種，累積自發(fā)突變體結構類似物：在化學和空間結構上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質。篩選抗性株，可成為高產(chǎn)株抗性突變株的篩選直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。往往低產(chǎn)甚至不產(chǎn)所需的產(chǎn)物，只有經(jīng)過進一步的人工改造才能真正用于工業(yè)生產(chǎn)菌種選育突變、體內重組體外重組（基因工程）（3）誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種微生物在生理和形態(tài)上的變化只要是可遺傳的都稱為變異。變異~~環(huán)境變化而出現(xiàn)的變化誘變機制三種類型：微小損傷突變、染色體畸變（大損傷突變）、染色體組突變。1、微小損傷突變堿基置換：ACC->GCC=>色氨酸UGG->精氨酸CGG，蛋白質發(fā)生改變碼組移動突變：在DNA分子的某一位置缺失或插入一對或幾對核苷酸堿基而使遺傳密碼移位。2、染色體畸變（大損傷突變）由遺傳物質的缺失、重復或重排而造成的染色體異常突變。包括一條染色體內發(fā)生的畸變和非同源染色體之間發(fā)生的畸變易位：非同源染色體之間部分相連接的現(xiàn)象。倒位：染色體的某一部分以顛倒的順序出現(xiàn)在原來位置上缺失：染色體上失去一個或多個基因遺傳物質的節(jié)段重復：染色體上增加一段染色體片段，使同一染色體上某些基因重復出現(xiàn)。注意易位和倒位都使基因排列順序改變，而基因數(shù)目不變。對染色體畸變而言，缺失是指足夠長的DNA片段的缺失，而不是單個核苷酸的缺失（碼組移動突變）。3、染色體組突變指由有絲分裂或減數(shù)分裂異常而產(chǎn)生的染色體數(shù)目或組數(shù)的變化。誘變劑誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑物理：紫外線，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍,5-Br-U{生物：噬菌體物理誘變劑：紫外線、X-射線、γ-射線，快中子；目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全?；瘜W誘變劑：金屬離子、一般化學試劑、生物堿、抗代謝物、抗生素及高分子化合物、殺菌劑、染料、堿基類似物、5-氟尿嘧啶、烷化劑等。使用最多、最有效的是烷化劑。大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效根據(jù)化學誘變因素對DNA的作用形式可分為三類：與一個或多個核酸堿基起化學變化，引起DNA復制時堿基配對的轉換而導致變異。亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等與天然堿基十分接近的類似物摻入到DNA分子中而引起變異，如5-溴尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤等DNA分子上減少或增加一兩個堿基引起堿基突變點以下全部遺傳密碼轉錄和翻譯錯誤（碼組移動突變），如吖啶類物質。誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選篩選的方法

隨機篩選

形態(tài)

理性化篩選（4）雜交育種通過有性生殖進行(5)原生質體融合原生質體融合(protoplastfusion)：指通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。意義：打破了微生物的種界界限，可實現(xiàn)遠緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機會?？膳c其他育種方法相結合，如把常規(guī)誘變和原生質體誘變所獲得的優(yōu)良性狀，組合到一個單株中。原生質體融合育種去除了細胞壁障礙，親株基因組直接融合、交換、重組，在融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種各樣的基因重組，得到多種類型的重組子，并可進行多級融合（即兩個以上的親株融合）。融合重組頻率高，可用溫度、藥物或紫外線照射處理來純化親株一方或雙方，然后再融合、再生、篩選重組子。該技術操作簡便、重組頻率高，是一種很有效的遺傳育種手段，已用它來改良菌株，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，而且能打破種屬界限，產(chǎn)生重組子，并可能產(chǎn)生新化合物。去細胞壁融合篩選溶壁作用：不同菌株要求不同酶，細菌、放線菌可用溶菌酶；酵母用蝸牛酶；霉菌用纖維素酶和蝸牛酶融合：原生質球在高滲溶液中用PEG助融篩選：融合后在再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選融合重組子。原生質體融合的一般程序菌齡：采用對數(shù)前期的菌體進行酶解，原生質體形成率高培養(yǎng)基：選用限制性培養(yǎng)基PEG：引起凝集，有利原生質體間的親和外界因素：高滲溶液、再生培養(yǎng)基中加酵母膏促進再生影響融合的因素基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等（6）基因重組進化育種錯位PCR基本步驟(1)用DNaseI消化功能相同的一組基因片段(A)，從而產(chǎn)生隨機小片段(B)。(2)經(jīng)提純后，用無引物(經(jīng)變性后可互為引物)的類似PCR反應重新裝配這些小片段成完整長度的重組基因片段(C)，在裝記過程中被證明有低水平點突變產(chǎn)生。3)克隆并選擇正突變體(D)，并將正突變體的重組基因片段作新一輪的體外重組。項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規(guī)定向進化的比較篩選合理的篩選方法和程序是菌種選育的重要問題，其中初步篩選是關鍵性的步驟?？股氐挠N中初篩一般選擇隨機篩選方法，從中選出產(chǎn)量最高者進一步復篩，該方法較為可靠，但工作量大，需進行大量篩選。為提高篩選效果，根據(jù)抗生素生物合成直接或間接有關的某些性狀進行初步篩選，然后在合適條件下發(fā)酵并測定其生產(chǎn)抗生素的能力，即“理性化篩選”。從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如結構類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標記。具有較大實用性的有三種1.自身耐藥突變株2.結構類似物或前體類似物的耐受突變株3.營養(yǎng)缺陷及其回復突變株理性化篩選飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉化成營養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質三、菌種保藏在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。斜面低溫法：短期保存石蠟油封存法：中期保存沙土管：產(chǎn)孢子和芽孢的麩皮保存法：產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌，工廠用甘油懸液法：基因工程菌凍干保藏：最廣泛使用的方法。大部分菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久。且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸液氮法：最為有效，保藏15年以上，宿主保藏法：活細胞內寄生的微生物第三節(jié)、發(fā)酵設備及消毒滅菌一、發(fā)酵設備發(fā)酵罐是發(fā)酵工程中最重要的設備之一

一個優(yōu)良的培養(yǎng)裝置應具有：嚴密的結構良好的液體混合性能高的傳質和傳熱速率靈敏的檢測和控制儀表1、攪拌釜式反應器：目前使用

最廣泛的發(fā)酵反應器機械攪拌發(fā)酵罐1）適宜的徑高比，罐身較長，氧利用率較高2）能耐受一定的壓力3）攪拌通風裝置4）足夠的冷卻面積5）罐內要減少死角6）攪拌器的軸封要嚴密，以減少泄露罐體：培養(yǎng)微生物的巨大容器，密閉式的，在發(fā)酵過程中要保持一定的罐壓，通常滅菌的壓力約為2.5×105

Pa形狀，圓柱形，兩端橢圓形,受力均勻，減少死角，物料容易排除，高度與直徑比1.7-4：1，有力空氣利用率攪拌器檔板克服攪拌器運轉時液體產(chǎn)生的渦流，將徑向流動改變?yōu)檩S向流動，促使液體激烈翻動，增加溶氧速率消泡器鋸齒式、梳狀式及孔板式裝于攪拌軸上，齒面略高于液面直徑罐徑的0.8~0.9罐體表面各種裝置：

中大型發(fā)酵罐裝有供維修、清洗的入孔罐頂裝有窺鏡和孔燈，在其內面裝有壓縮空氣或蒸汽吹管罐頂接管：進料管、補料管、排氣管、接種管、壓力表接管罐身接管：冷卻水進出管、空氣進管、溫度計管和測控儀器接口（二）發(fā)酵輔助設備無菌空氣系統(tǒng)：過濾除菌（使用活性炭，石棉濾板，多孔合成樹脂等）滅菌系統(tǒng)發(fā)酵車間的管道閥門等發(fā)酵對無菌空氣的要求是：無菌，無灰塵，無雜質，無水，無油，正壓等幾項指標；發(fā)酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設計中一般要求1000次使用周期中只允許有一個菌通過，即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3

高空取氣管是遠離地面幾十米的管子。地面附近空氣中所含的微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個數(shù)量級因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。

油水分離器其內部同時采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴散及凝聚等機理，能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃，內部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長。

發(fā)酵車間的空氣過濾器二、培養(yǎng)基和滅菌（一）培養(yǎng)基C源：N源：無機鹽：前體，促進劑，抑制劑2.培養(yǎng)基的類型孢子培養(yǎng)基：一般用固體培養(yǎng)基，N源不能豐富如：小米或麩皮培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：速效的C,N源，與發(fā)酵培養(yǎng)基過渡發(fā)酵培養(yǎng)基：遲效與速效的C,N源搭配，加前體等（二）滅菌方法1.空罐滅菌：高壓水蒸氣，消滅死角當培養(yǎng)基（或物料）尚未進罐前對罐進行預先滅菌蒸汽下進上出2.實罐滅菌：效果最好，121度，30-50分鐘三路進汽：直接蒸汽從通風、取樣和出料口進入罐內直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時間。3.連續(xù)滅菌：營養(yǎng)破壞最少，128-138度，8-12分鐘。發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質滅菌產(chǎn)物分離純化成品二、種子的制備

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。谷氨酸生產(chǎn)的種子制備斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵1、斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12h培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。種子制備的過程二、微生物的發(fā)酵方式分批發(fā)酵補料分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵一、分批發(fā)酵

簡單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時間變化。優(yōu)點操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質量容易掌握缺點產(chǎn)率低，不適于測定動力學數(shù)據(jù)分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對數(shù)生長期穩(wěn)定期死亡期遲滯期，菌體沒有分裂只有生長。對數(shù)生長期,當細胞內的與細胞分裂相關的物質濃度達到一定程度，細胞開始分裂，這時細胞生長很快。隨著細胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物減少，廢物積累，導致細胞生長速率下降，進入減速期和穩(wěn)定期。最后當細胞死亡速率大于生成速率，進入死亡期對于初級代謝產(chǎn)物，在對數(shù)生長期初期就開始合成并積累，而次級代謝產(chǎn)物則在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成。二、補料分批培養(yǎng)在分批培養(yǎng)過程中補入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導致的發(fā)酵過早結束的缺點。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。在工廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多補料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應；可以通過補料控制達到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計算機控制合理的補料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。缺點由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌機會三、半連續(xù)培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)基礎上，加上間歇放掉部分發(fā)酵液進入下游提取的操作方式。某些品種采取這種方式，如四環(huán)素發(fā)酵優(yōu)點放掉部分發(fā)酵液，再補入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。缺點代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大四、連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵過程中一邊補入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內的體積維持恒定。達到穩(wěn)態(tài)后，整個過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質濃度都是恒定的。1.罐式連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)液以一定的流速不斷地流加到帶機械攪拌的發(fā)酵罐中，與罐內發(fā)酵液充分混合，同時帶有細胞和產(chǎn)物的發(fā)酵液又以同樣流速連續(xù)流出。如果用一個裝置將流出的發(fā)酵液中部分細胞返回發(fā)酵罐，就構成循環(huán)系統(tǒng)。2.管式連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵液通過沒有混返的管狀反應器向前流動管道的形式有多種，如直線形、S形、蛇形管等。培養(yǎng)液和從種子罐來的種子不斷流入管道發(fā)酵器內，使微生物在其中生長。這種連續(xù)發(fā)酵的方法主要用于厭氧發(fā)酵。如在管道中用隔板加以分隔，每一個分隔等于一臺發(fā)酵罐，就相當于多罐串聯(lián)的連續(xù)發(fā)酵。

連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點

優(yōu)點：控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化。發(fā)酵周期長，得到高的產(chǎn)量。通過改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長的動力學缺點：菌種不穩(wěn)定的話，長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點菌種本身的代謝特點，生長速率、呼吸強度、營養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率菌代謝與環(huán)境的相關性，溫度、pH、滲透壓、離子強度、溶氧濃度、剪切力等三、發(fā)酵過程中的中間分析項目（一）產(chǎn)量發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物的積累，以發(fā)酵單位表示化學測定法：簡單，但受結構類似物的影響，發(fā)酵過程中采用。生物測定法：麻煩，人為誤差大。發(fā)酵終點采用（二）PHpH與微生物的生命活動密切相關-酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映-基質代謝、產(chǎn)物合成、細胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況（三）糖糖的消耗反映產(chǎn)生菌的生長繁殖情況；反映產(chǎn)物合成的活力菌體生長旺盛糖耗一定快，殘?zhí)且簿徒档偷每焱ㄟ^糖含量的測定，可以控制菌體生長速率，可控制補糖來調節(jié)pH，促進產(chǎn)物合成，不致于盲目補糖，造成發(fā)酵不正常。糖含量測定包括總糖和還原糖?？偺侵赴l(fā)酵液中殘留的各種糖的總量。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖。還原糖指含有自由醛基的單糖，通常指的是葡萄糖。（四）氨基氮氨基氮指有機氮中的氮氮利用快慢可分析出菌體生長情況，含氮產(chǎn)物合成情況。但是氮源太多會促使菌體大量生長。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。通過氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過程，適時采取補氨措施。發(fā)酵后期氨基氮回升，這時就要放罐，否則影響提取過程。（五）菌絲形態(tài)四、發(fā)酵過程的影響因素及控制發(fā)酵過程控制是發(fā)酵的重要部分同樣的菌種，同樣的培養(yǎng)基在不同工廠，不同批次會得到不同的結果，可見發(fā)酵過程的影響因素是復雜的，比如設備的差別、水的差別、培養(yǎng)基滅菌的差別，菌種保藏時間的長短，發(fā)酵過程的細微差別都會引起微生物代謝的不同。了解和掌握分析發(fā)酵過程的一般方法對于控制代謝是十分必要的（一）菌體濃度的影響及控制菌體濃度反應菌體細胞數(shù)和勝利特性結構越復雜的生物，分裂所需時間越長發(fā)酵中菌液需控制在合理濃度中，過高，營養(yǎng)消耗過快，有毒廢物積累，改變菌體代謝途徑，影響溶氧；過低，產(chǎn)率下降依靠調節(jié)培養(yǎng)基和補料控制菌體濃度（二）培養(yǎng)基的影響及其控制1.碳源葡萄糖速效碳源，生長菌體淀粉等遲效碳源，發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物一般在發(fā)酵中后期為保證產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，有意使菌體處于半饑餓狀態(tài)，在營養(yǎng)限制的條件下，維持產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的速率在較高水平。2.氮源氨基酸，玉米漿等速效氮源，生長菌體豆餅等遲效氮源，發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物氮源太多會促使菌體大量生長。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。3.磷酸鹽和微量元素微生物體內磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來計算磷含量的是磷酸根抗生素對磷酸鹽濃度很敏感生長濃度：0.32-300M生產(chǎn)濃度：1.0M采用生長亞適量磷酸鹽濃度4.補料補基質和前體中途補料，豐富培養(yǎng)基，避免菌體過早衰老，控制PH，改善通氣等通常在生長旺盛期后期，發(fā)酵液泡沫位下降，這時耗氧大，溶氧水平接近臨界點補料少量多次（三）溫度的影響及其控制1、溫度影響反應速率發(fā)酵過程的反應速率實際是酶反應速率，酶反應有一個最適溫度。另外，溫度影響發(fā)酵液的物理性質2、溫度影響發(fā)酵方向四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當溫度低于30C時，這種菌合成金霉素能力較強；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達到35C時，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。1.影響發(fā)酵溫度變化的因素(1)生物熱微生物進行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。(2)攪拌熱(3)蒸發(fā)熱通氣時，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱(4)輻射熱發(fā)酵罐內溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。2.溫度的選擇與控制(1)最適溫度的選擇嗜冷菌適應于0～26度生長，嗜溫菌適應于15～43度生長，嗜熱菌適應于37～65度生長，嗜高溫菌適應于65度以上生長最適生長溫度不一定最適生產(chǎn)（發(fā)酵）溫度最適發(fā)酵溫度受菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和菌體生長階段等影響。理論上來講，發(fā)酵過程不應只選一個溫度，應根據(jù)不同階段選擇不同的培養(yǎng)溫度：生長階段：最適生長溫度產(chǎn)物分泌階段：最適生產(chǎn)溫度實際中……發(fā)酵前期要盡快達到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長迅速；中期菌量已達到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因為在稍低溫度下氨基酸合成蛋白質和核酸的正常途徑關閉得比較嚴密有利于產(chǎn)物合成。發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長階段28C，合成期26C后期再升溫；黑曲霉生長37C，產(chǎn)糖化酶32～34C。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長30～32C，產(chǎn)酸34～37C。(2)溫度的控制冷卻水（四）pH的影響及其控制pH與微生物的生命活動密切相關——

酶催化活性pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映——基質代謝、產(chǎn)物合成、細胞狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、供氧狀況通過觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否1、發(fā)酵過程的pH控制發(fā)酵過程中pH是不斷變化的，通過觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否2、產(chǎn)物形成某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。3、菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升實例：pH對林可霉素發(fā)酵的影響林可霉素發(fā)酵開始，葡萄糖轉化為有機酸類中間產(chǎn)物，發(fā)酵液pH下降，待有機酸被生產(chǎn)菌利用，pH上升。若不及時補糖、(NH4)2SO4或酸，發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上，阻礙或抑制某些酶系，使林可霉素增長緩慢，甚至停止。對照罐發(fā)酵66小時pH達7.93，以后維持在8.0以上至115小時，菌絲濃度降低，NH2-N升高，發(fā)酵不再繼續(xù)。發(fā)酵15小時左右，pH值可以從消后的6.5左右下降到5.3，調節(jié)這一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高發(fā)酵單位。發(fā)酵過程pH變化的原因

（1）糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一（2）氮代謝：當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質利用后pH會上升或下降1.調節(jié)好基礎料的pH?；A料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調到6.5－6.8２.在基礎料中加入維持pH的物質，如CaCO3

，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等３.通過補料調節(jié)pH４.當補料與調pH發(fā)生矛盾時，加酸堿調pH（五）溶氧的影響及其控制溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。供氧不足，代謝異常通氣，攪拌1.溶氧的影響在28℃氧在發(fā)酵液中的100％的空氣飽和濃度只有0.25M左右，比糖的溶解度小7000倍。在對數(shù)生長期即使發(fā)酵液中的溶氧能達到100％空氣飽和度，若此時中止供氧，發(fā)酵液中溶氧可在幾秒（分）鐘之內便耗竭，使溶氧成為限制因素2.發(fā)酵過程的溶氧變化發(fā)酵初期，生產(chǎn)菌大量繁殖，需氧，溶氧下降過了生長階段，需氧減少，溶氧上升發(fā)酵中后期，分批發(fā)酵的溶氧不變生產(chǎn)后期，菌體衰老，溶氧上升溶氧異常變化：明顯降低或升高，常見是溶氧下降。（原因：耗氧或供養(yǎng)出現(xiàn)了異常因素或發(fā)生了障礙，見p273）3.溶氧濃度的控制通氣，攪拌補料調節(jié)溫度（降低培養(yǎng)溫度能提高溶氧濃度）液化培養(yǎng)基中間補水添加表面活性劑（六）CO2的影響及控制CO2是微生物代謝產(chǎn)物，溶解在發(fā)酵液中的CO2對發(fā)酵有刺激或抑制作用CO2和HCO3影響膜的結構CO2使PH下降影響菌體的呼吸速率等CO2對產(chǎn)物抑制，則降低濃度，對產(chǎn)物促進，則增加濃度降低通氣攪拌，則增加CO2在發(fā)酵液中溶解度（七）發(fā)酵過程泡沫的形成與控制發(fā)酵過程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過多的泡沫是有害的泡沫產(chǎn)生的