第一章7節(jié)酶的純化方法

2、酶的純化方法現(xiàn)行的方法（根據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的）：（1）根據(jù)溶解度的不同；（2）根據(jù)分子大小的差別；（3）根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)；（4）利用穩(wěn)定性的差異；（5基于酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專(zhuān)一的親和作用的特點(diǎn)。實(shí)際有許多方法中往往包含兩種或兩種以上的因素在同時(shí)起作用。（三）根據(jù)溶解度建立的純化方法1.鹽析法;2.有機(jī)溶劑沉淀法;3.共沉淀法;4.選擇性沉淀法;5.等電點(diǎn)沉淀法1鹽析法鹽析法是古老的、也是目前仍廣泛采用的方法。鹽析法的原理：球蛋白類(lèi)在低的鹽濃度溶液中，它的溶解度隨鹽的離子強(qiáng)度升高而增大，表現(xiàn)“鹽溶”特性。但是當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高，超過(guò)某一上限值時(shí)，其溶解度又會(huì)先后以不同速度下降，分別“鹽析”沉淀析出。鹽析純化法就是根據(jù)酶和雜蛋白在高的鹽濃度溶液中溶解度的差別而建立的一種純化方法。鹽析應(yīng)考慮下述因素：

(1)pH(2)鹽

(3)溫度

(4)蛋白質(zhì)濃度

(5)其它(1)pH

控制pH可以提高純化效果，一般pH可選擇的范圍不大，大多數(shù)情況下，鹽析的適宜pH接近于待純化酶的等電點(diǎn)。有些情況，酶和雜蛋白能形成某種結(jié)合，從而干擾鹽析分離，此時(shí)如控制pH＜5或＞6，使它們帶相同電荷以減少絡(luò)合物形成，這樣鹽析效果常會(huì)有所改善，但應(yīng)注意酶在這種條件下的穩(wěn)定性與鹽的溶解度。

(2)鹽

在純化的最初階段，鹽的性質(zhì)產(chǎn)生的影響不一定很明顯，僅是隨著酶溶液純度的提高，鹽的特征效應(yīng)就可能突出出來(lái)。實(shí)踐表明，就陽(yáng)離子來(lái)說(shuō)，一價(jià)鹽通常比二價(jià)鹽有效；而陰離子則相反，二價(jià)鹽比一價(jià)鹽好。符合這種條件的鹽有硫酸銨、硫酸鈉等。硫酸銨最常用，它的最大優(yōu)點(diǎn)是溶解度大，溶解的溫度系數(shù)小(0℃，706克／升；25℃，767克／升)即使在低溫下的溶解度范圍內(nèi)，幾乎所有蛋白質(zhì)都能鹽析出來(lái)。(3)溫度

從酶的穩(wěn)定性和溶解度看，鹽析溫度一般以控制℃在30左右為宜。(4)蛋白質(zhì)濃度這是一個(gè)很重要的因素，它一方面能影響鹽析效果的重現(xiàn)性，因?yàn)榈鞍诐舛炔煌?，分?jí)分離納范圍也往往會(huì)發(fā)生變動(dòng)；另一方面，蛋白濃度在100μg/ml以下，鹽析一般很因難，有時(shí)甚至根本不能形成沉淀。在200μg—1mg／ml范圍內(nèi)，沉淀雖能生成，但時(shí)間校長(zhǎng)，而且回收率往往不高。為了獲得較好的鹽析效果，蛋白濃度應(yīng)在1mg／ml以上。(5)其它

鹽析沉淀通常至少要近一小時(shí)才能完成，沉淀可通過(guò)離心或壓濾和母液分離。鹽濃度低時(shí)，離心比較容易，而過(guò)濾較難；鹽濃度高時(shí)，需要高速離心，但過(guò)濾較易。

鹽析法的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、安全(大多數(shù)酶在高濃度鹽溶液中相當(dāng)穩(wěn)定)、重現(xiàn)性好。缺點(diǎn)：分辨率低，純度提高不顯著，同時(shí)為了下一步純化有時(shí)還需脫鹽。

2.有機(jī)溶劑沉淀法原理:不同的蛋白質(zhì)需要加入不同量的有機(jī)溶劑才能使它們分別從溶液中沉淀析出。有機(jī)溶劑在這個(gè)過(guò)程的主要作用是降低溶液的介電常數(shù)，因?yàn)榉肿娱g的靜電引力和溶劑的介電常數(shù)成反比，加入有機(jī)溶劑，蛋白質(zhì)分子問(wèn)的引力增加，溶解度降低。有機(jī)溶劑的另一作用是部分地引起蛋白質(zhì)脫水而沉淀。但是有機(jī)溶劑的濃度和蛋白質(zhì)溶解度之間目前還沒(méi)有一個(gè)可用的關(guān)系式。有機(jī)溶劑沉淀法應(yīng)考慮的因素是：

(1)溫度

(2)pH(3)離子強(qiáng)度

(4)有機(jī)溶劑

(1)溫度

這是非常重要的因素，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)遇到有機(jī)溶劑都很不穩(wěn)定，特別是溫度較高的情況(例如室溫)下，極易變性失效，故操作過(guò)程通常應(yīng)控制在0℃以下。而且有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷卻到-15—-20℃，然后在攪拌下緩慢地加入。沉淀析出后應(yīng)盡快地在低溫下離心分離，獲得的沉淀也應(yīng)立即用冷的緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度。個(gè)別情況下，酶對(duì)有機(jī)溶劑比較穩(wěn)定，此時(shí)操作可在較高溫度(例如室溫)下進(jìn)行，這樣有利于除去較多的雜蛋白。(2)pH

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最低，有機(jī)溶劑沉淀通常也多選在盡可能靠近待純化酶的等電點(diǎn)pH條件下進(jìn)行。如肌肉酶的分離在pH6.5效果一般較好，pH調(diào)整可用0.05M的緩沖液。(3)離子強(qiáng)度

中性鹽大多能增大蛋白質(zhì)的溶解度，并能減少變性影響。在進(jìn)行有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀時(shí)，如果添加適當(dāng)濃度的中性鹽，如5—10％的硫酸銨，往往有助于提高分離效果。但鹽的濃度一般不宜超過(guò)0.05M，否則沉淀不好，甚至沉淀全無(wú)，同時(shí)有機(jī)溶劑耗費(fèi)也大。(4)有機(jī)溶劑

丙酮的分離效果一般最好，引起失效的情況與程度也較少(小)。除了丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。

3共沉淀法

原理:這是利用離子型表面活性劑如SDS(十二烷基磺酸鈉)、非離子型聚合物如聚乙二醇、聚乙烯亞胺以及丹寧酸、硫酸鏈霉素等，在一定條件下能與蛋白質(zhì)直接或間接形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)沉淀析出．然后再用適當(dāng)方法使需要的酶溶解出來(lái)，除去雜蛋白和沉淀劑，從而達(dá)到純化目的的方法。4選擇性沉淀法

原理:某些多聚電解質(zhì)如聚丙烯酸、硫酸糊精以及磷、砷、硅的鎢、鉬、釩等的雜多酸常能在極低的濃度條件下，選擇性地和某種或某類(lèi)酶結(jié)合沉淀析出，其選擇性的機(jī)制尚不清楚。以聚丙烯酸(PAA)為例，它的分子量近9000或近300,000的聚合物對(duì)某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有選擇性沉淀效果，故可用于這些酶的純化.

5等電點(diǎn)沉淀法原理：蛋白質(zhì)的溶解度隨分子間引力增大而變小，當(dāng)其它條件相同時(shí)，分子間的引力以蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)狀態(tài)最大，因而容易析出沉淀。不過(guò)由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度，故沉淀往往不完全，一般很少單獨(dú)使用，更多的是作為其它沉淀法中的一個(gè)組合條件。但是，這種方法有時(shí)可用于對(duì)付雜蛋白種類(lèi)較多的樣品，因?yàn)閷⑦@種樣品的pH調(diào)整至某一值后，不僅會(huì)使處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)沉淀，也可使處于等電點(diǎn)兩側(cè)帶相反電荷的雜質(zhì)形成復(fù)合物而沉淀，從而可除去大量雜蛋白。（四）根據(jù)分子大小的建立純化方法：１.膠過(guò)濾(層析)法；２.篩膜分離法；３.超離心法分離。１.膠過(guò)濾(層析)法原理：必須以層析的方式進(jìn)行．柱中填充分子篩介質(zhì),用于生物大分子分離的分子篩介質(zhì)是具有一定孔徑的球狀凝膠物質(zhì).層析柱中裝入某種孔徑的凝膠物質(zhì)以后,再加入待純化樣品,然后用適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液使該樣品自上而下地?cái)U(kuò)展.這樣,樣品中的各種分子就將按其分子大小表現(xiàn)不同的層析性態(tài)而分離.大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi),它們只能沿膠粒間隙擴(kuò)展,因而“走”的是一條較“直”的“路”,表現(xiàn)出較快的移動(dòng)速度;反之,小于凝膠孔徑的分子,由于它們能自由進(jìn)出膠粒內(nèi)外,按照分子熱運(yùn)動(dòng)的規(guī)律,其運(yùn)動(dòng)軌跡“迂回曲折”,因此,表現(xiàn)較慢的下移速度.所以只要待純化樣品通過(guò)一定長(zhǎng)度的層析柱后,不同大小的分子就將按先后顧序依次流出,彼此分開(kāi).膠過(guò)濾(層析)法原理膠過(guò)濾(層析)法應(yīng)考慮的因素:(1)膠的選擇（葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠）;(2)柱層析的過(guò)程與要求；

(3)膠過(guò)濾中膠的用量（與樣品體積有關(guān)）;(4)其它有關(guān)問(wèn)題(樣品，洗脫液，膠的再生與保存）．

(1)膠的選擇

作為分子篩的凝膠是由親水的線狀聚合物通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)、或通過(guò)聚合物自身締合組成具有網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)的膠粒物質(zhì)。網(wǎng)眼孔徑大小由交聯(lián)程度或聚合物的濃度決定。最常用的凝膠有:(i)葡聚糖凝膠

(ii)聚丙烯酰胺凝膠

(iii)瓊脂糖凝膠

葡聚糖凝膠：這是分子量從幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)的葡聚糖通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)?？捎糜诜蛛x分子量1000—500，000的分子。以商品SephdexG—為例，G—以后的數(shù)字為膠膨潤(rùn)時(shí)吸水量的10倍，如Ｇ—25就表示該膠物質(zhì)每1g能吸水2.5m1，這個(gè)數(shù)字越大說(shuō)明吸水量越高，孔徑也越大，更適于分離較大的分子.此外,還有SephdexLH—，是兼具親脂性和親水性的凝膠，可用于脂類(lèi)化合物的分離；SephacylS—可用于水溶液和有機(jī)溶劑系統(tǒng)，或高濃度氫鍵解離試劑存在的系統(tǒng)．各種葡聚糖凝膠G(2)柱層析的基本過(guò)程與要求

過(guò)程：層析介質(zhì)的平衡；裝柱；加樣；擴(kuò)展(包括洗滌和洗脫)以及與此同時(shí)進(jìn)行流出液成分(蛋白質(zhì)或酶活性)的檢測(cè)和分部收集。

分離效果的標(biāo)準(zhǔn)：分辨率高，回收率高；稀釋度小和速度快。其中分辨率可用Rs權(quán)衡：

Rs＝兩峰帶間距離／峰帶寬當(dāng)Rs＝1.2時(shí)，通常認(rèn)為基本上達(dá)到了分離要求.膠過(guò)濾法的特點(diǎn):

不受pH、鹽和溫度等的影響；操作條件溫和、簡(jiǎn)便，勿需特殊的再生處理，適于各種分子的分離．

2.篩膜分離法

原理:篩膜分離法也即超過(guò)濾分離法，它是利用微孔超濾膜僅能選擇性地透過(guò)一定大小的分子而達(dá)到分離目的一類(lèi)方法。

特點(diǎn):它操作比較簡(jiǎn)單，條件也溫和，但是只能達(dá)到粗分的要求。

3超離心分離法

原理:這是利用樣品中不同大小的分子在相對(duì)離心力場(chǎng)達(dá)80，000一250，000g的條件下分布不同而進(jìn)行分離純化的一種方法。

應(yīng)用:此法主要用于病毒、細(xì)胞顆粒體等的制備，對(duì)分子量較小的酶或蛋白質(zhì)分離效果一般不佳，分辨率不高而且費(fèi)時(shí).五.根據(jù)解離電學(xué)性質(zhì)的特點(diǎn)建立的純化方法:1.吸附交換(層析)法;2.電泳法;3.聚焦層析法。

1吸附交換(層析)分離法這是最常用的一類(lèi)純化方法。

原理:利用待純化樣品中不同的分子和吸附劑間的吸附與解吸性質(zhì)的不同而達(dá)到分離。這類(lèi)分離或以靜態(tài)吸附方式進(jìn)行，或以層析吸附方式進(jìn)行。過(guò)程:有三個(gè)主要環(huán)節(jié)：加樣吸附、洗滌和洗脫。實(shí)際上每一個(gè)環(huán)節(jié)都包含目的酶和雜蛋白的分離，因此是一種十分有效的純化方法。吸附交換分離法原理示意

吸附劑:根據(jù)吸附機(jī)制的不同可分為三種類(lèi)型：

1.“傳統(tǒng)”的物理吸附劑;2.羥基磷灰石;3.離子交換吸附劑。

(1)物理吸附

傳統(tǒng)的物理吸附劑常用的有白土、氧化鋁和磷酸鈣膠等。其中白土是以硅酸鋁為主要成分的具有強(qiáng)吸附力的一類(lèi)粘土，包括皂土、高嶺土和活性白土等；氧化鋁根據(jù)制備方法不同有多種成品，磷酸鈣膠可從氧化鈣和磷酸三鈉直接制備。物理吸附的原理:

一般認(rèn)為它是由于吸附劑界面分子和樣品分子間相互作用的范德華力所引起；因而選擇性不強(qiáng)預(yù)見(jiàn)性較小，往往需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)加以確定。這類(lèi)吸附劑應(yīng)用很早，但沒(méi)有得到更大的發(fā)展，原因可能也就在于此。(2)羥基磷灰石吸附：近年來(lái)應(yīng)用羥基磷灰石作為吸附劑的日期增多，它是一種微晶型的磷酸鈣制品。原理:

一般認(rèn)為是，這種晶體表面的鈣離子能和蛋白質(zhì)的負(fù)電性基團(tuán)相互作用，而磷酸基團(tuán)則能和正電性基團(tuán)結(jié)合。如果在系統(tǒng)中有對(duì)鈣親和力更強(qiáng)的離子(如檸檬酸鹽)存在時(shí)，羥基磷灰石對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力就會(huì)顯著下降，但是其它鹽如NaCl等，即使?jié)舛群芨?，也不?huì)影響蛋白質(zhì)的負(fù)電性基團(tuán)和鈣之間的結(jié)合。反之，這些鹽可以大大降低正電性基團(tuán)的作用，也就是說(shuō)在鹽濃度很高的溶液，羥基磷灰石可用來(lái)吸附酸性或中性蛋白，而排除堿性蛋白，這樣就可以省去吸附前的脫鹽透析平衡。羥基磷灰石對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量比較高，在一般吸附操作條件下約50克／升床體積。

(3)離子交換吸附原理:這類(lèi)吸附是在蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)與離子交換劑的解離基團(tuán)之間的解離交換過(guò)程中進(jìn)行的。由于各種蛋白質(zhì)和離子交換劑在不同條件下有相應(yīng)不同的解離狀態(tài)，因此通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)慕粨Q劑、控制交換和洗脫條件，就可將酶和雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。

分類(lèi):離子交換劑包括兩個(gè)部分：載體和離子交換基團(tuán)。常用的吸附劑有：離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維素和離子交換凝膠。離子交換樹(shù)脂是以交聯(lián)的聚苯乙烯樹(shù)脂等為載體，再導(dǎo)入相應(yīng)的解離基團(tuán)而成;離子交換纖維素是目前酶的純化工作中用得最多的交換劑，它是以親水的纖維素為載體，在引入相應(yīng)的交換基團(tuán)后制成的;離子交換凝膠以葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠為載體，導(dǎo)入相應(yīng)的交換基團(tuán)后制成。

按離子交換基團(tuán)分類(lèi):

離子交換基團(tuán)是交換劑表現(xiàn)功能的基礎(chǔ)，它的性質(zhì)決定交換劑的類(lèi)型與強(qiáng)弱。帶陽(yáng)電荷解離基的交換劑在離子交換過(guò)程中能吸附荷陰電的離子，故稱(chēng)為陰離子交換劑；反之，帶陰電荷解離基的交換劑可對(duì)付荷陽(yáng)電離子，稱(chēng)為陽(yáng)離子交換劑。

離子交換劑的選擇依據(jù)：首先是待分離酶(或蛋白)的穩(wěn)定性;

其次是強(qiáng)型和弱型交換劑的選擇;

第三是交換容量,交換容量有兩方面的含義,一為總的交換容量；一為實(shí)效交換容量。前者是指每克干離子交換劑上帶有的總交換基數(shù)目，其中包括潛在的交換基；后者是指特定的實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)際可用于交換的交換基數(shù)目;

第四是流速,纖維素柱的流速一般低于凝膠。

待分離酶(或蛋白)的穩(wěn)定性的選擇:(i)如果待分離的酶在低于其pI的pH條件下穩(wěn)定，則可選用陽(yáng)離子交換劑;(ii)如果待分離的酶在高于其pI的pH條件下穩(wěn)定，則采用陰離子交換劑;(iii)如果待分離的酶在高于和低于其pI的pH條件下都穩(wěn)定，則兩種交換劑都可以考慮。

交換劑類(lèi)型的選擇:(i)如果待分離酶的pI偏向極端(小于6或大于9)一般應(yīng)考慮強(qiáng)型交換劑，因強(qiáng)型交換基能在廣泛的pH范圍內(nèi)保持解離狀態(tài)，而弱型的交換基的解離和pH條件密切相關(guān);弱型陽(yáng)離子交換劑在pH6以下，陰離子交換劉在pH9以上開(kāi)始不帶電荷失去交換能力。

(ii)如果待分離的酶既可應(yīng)用強(qiáng)型交換劑，也可用弱型交換劑，但是酶不穩(wěn)定，此時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮選擇弱型。

優(yōu)點(diǎn):

離子交換吸附法是目前僅次于鹽析的一種常用的純化方法。它的適用面廣，幾乎所有的蛋白都可用此法分離；其次是它具有很高的分辨率和回收率。

2電泳分離法原理:

這是根據(jù)各種蛋白質(zhì)解離、電學(xué)性質(zhì)上的差異，利用它們?cè)陔妶?chǎng)中的遷移方向與遷移速度不同而進(jìn)行純化的一類(lèi)方法。特點(diǎn):這類(lèi)方法可以達(dá)到很高的分辨效果，但在實(shí)驗(yàn)放大和樣品回收方面有一定困難，因此目前主要用于蛋白質(zhì)的分析和小規(guī)模制備。

常用的電泳方法可大致分為以下幾種類(lèi)型：

(1)自由界面電泳它需要復(fù)雜的設(shè)備，而且待分離物質(zhì)往往不能完全分開(kāi)，故現(xiàn)在僅用于純酶均一性的檢定。

(2)區(qū)帶電泳

這是在惰性支持物上進(jìn)行的一類(lèi)電泳分離分析法。和前一類(lèi)相比，它具有簡(jiǎn)便靈活，無(wú)對(duì)流擴(kuò)散，可達(dá)到完全分離等優(yōu)點(diǎn)。區(qū)帶電泳分類(lèi):

第一種最簡(jiǎn)單的是膜電泳，它以濾紙、醋酸纖維素薄膜為支持物，簡(jiǎn)易快速，但分離量很低，只能用于蛋白質(zhì)粗分析。第二種區(qū)帶電泳是粉末電泳，常用的支持物為淀粉與醇化的纖維素。

第三種是凝膠電泳，這種電泳兼具分子篩效應(yīng)，因而可達(dá)到很高的分辨率。早期用的支持物為淀粉膠，近年來(lái)主要應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠，這種膠能更嚴(yán)格地控制膠孔徑。SDS(3)等電聚焦電泳

這是利用兩性電解質(zhì)載體--一種多乙烯多胺與丙烯酸加合反應(yīng)得到的同系多異構(gòu)體混合物，它們具有相近的pK值與pI值—在電場(chǎng)作用下能形成連續(xù)平滑的pH梯度，待分離樣品中各組份在電泳過(guò)程中，又能按照各自的等電點(diǎn)聚焦到相應(yīng)的pH梯度位置上從而達(dá)到分離目的。等電聚焦圖譜3聚焦層析

特點(diǎn):聚焦層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差別進(jìn)行層析分離的純化方法。它不需要特別的聚焦電泳裝置，但兼具等電聚焦電泳的高分辨率和柱層析的簡(jiǎn)便性?xún)煞N特點(diǎn)。

原理:當(dāng)用特定的多緩沖液滴定和淋洗填裝在層折柱中的特定多緩沖交換劑時(shí)，隨著這種緩沖液的擴(kuò)展，就會(huì)在層析柱中自上而下地建立起pH梯度；而該層析柱中的蛋白質(zhì)也將隨多緩沖液的擴(kuò)展按各自的等電點(diǎn)聚焦于相應(yīng)的pH區(qū)段，并隨擴(kuò)展過(guò)程pH梯度的逐漸下移而下移，最后分別從層析柱先后洗出，達(dá)到分離純化的目的。

六．利用穩(wěn)定性的差異建立的純化方法:

選擇性變性法就是根據(jù)酶和雜蛋白在某種條件下穩(wěn)定性的差別，而采取的一類(lèi)可一舉除去大量雜蛋白的簡(jiǎn)便純化方法。

1.選擇性熱變性法;2.選擇性酸堿變性法;3.選擇性表面變性法。

1選擇性熱變性如果待分離的酶相當(dāng)耐熱，那末就可在嚴(yán)格控制的條件下，將酶溶液迅速升溫到它穩(wěn)定的溫度(如50-70℃)，并保溫一定時(shí)間(如5-15分鐘)，而后迅速冷卻，這樣大量不耐熱的雜蛋白就將變性析出，離心除去后，酶的比活力就將大大提高，而總活力損失很少或者根本不損失，有時(shí)甚至還可能有所提高。

2酸堿變性法如果能?chē)?yán)格地將酶溶液控制在酶穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)用酸堿處理一定時(shí)間，進(jìn)行選擇性變性，同樣也可達(dá)到有效的純化目的。

和選擇性熱變性相比，酸堿變性應(yīng)用得不多，主要原因可能在于操作較為復(fù)雜，而且純化效果較差。

3表面變性法利用酶溶液和惰性液體(如氯仿)混合振蕩，造成選擇性表面變性來(lái)制備過(guò)氧化氫酶、醇脫氫酶和α-淀粉酶等。振蕩處理后通常分成三層：上層為未變性蛋白；第二層為乳濁狀變性蛋白；下層為氯仿。這種處理時(shí)間不宜長(zhǎng)，否則將導(dǎo)致所有蛋白質(zhì)變性。七根據(jù)專(zhuān)一的親和作用建立的純化方法

1.親和層析法;2.親和電泳法1親和層析法親和層析法是據(jù)生物分子間某種特有的親和力而建立的一種新型純化方法。

原理:酶和它的底物(包括輔助因子)、底物類(lèi)似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常都具有較高的親和力，能專(zhuān)一而可逆地形成酶—配基絡(luò)合物。因此，如果將這類(lèi)配基偶聯(lián)固定于樣品中，那么，它就能迅速而有選擇性地將相應(yīng)的酶分子從溶液中分離出來(lái)，達(dá)到和其它雜蛋白分離的目的，這就是親和吸附。2.親和電泳法:

親和電泳法是將親和層析和聚丙烯酰胺膠電泳結(jié)合在一起的高分子分離分析方法。

原理：當(dāng)相應(yīng)的親和配基共價(jià)偶聯(lián)于電泳膠(即載體，通常多用聚丙烯酰胺)上以后，由于具有親和作用的待分離分析成份和配基具有結(jié)合力，在電泳過(guò)程中不會(huì)移動(dòng)，而不具親和性的成份將按各自的電泳速度而分離開(kāi)來(lái)。

八結(jié)晶所謂結(jié)晶，是指分子通過(guò)氫鍵、離子鍵或分子間力，按規(guī)則且周期性排列的一種固體形式。

由于各種分子形成結(jié)晶的條件不同，也由于變性的蛋白質(zhì)和酶不能形成結(jié)晶，因此，結(jié)晶既是一種酶是否純凈的標(biāo)志，也是一種酶和雜蛋白分離純化的手段。

為了獲得純凈、粒大、收得率高的結(jié)晶應(yīng)注意：

(1)酶溶液應(yīng)該達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌瘸松贁?shù)例外，不純的溶液是不能得到結(jié)晶的。

(2)酶的濃度要恰到好處一般以1—5％為宜，不宜小于0.2％，濃度高雖然較易結(jié)晶，但如果過(guò)于飽和，只能獲得大量微晶，難以形成大晶體。結(jié)晶方法：1.鹽析結(jié)晶2.有機(jī)溶劑結(jié)晶3.透析平衡結(jié)晶4.等電點(diǎn)結(jié)晶九.濃縮與干燥1.濃縮真空濃縮2.干燥方法真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥吸附干燥四酶的純度和產(chǎn)量

（一）活力測(cè)定在酶的抽提和純化過(guò)程中，為了了解所選擇的方法和條件是否適宜，每一步驟前后都應(yīng)進(jìn)行酶的活力測(cè)定，作出總活力與比活力的比較。

如何進(jìn)行酶的活力測(cè)定：

(1)如果待分離的酶已有報(bào)導(dǎo)，可參考它所采用的測(cè)定方法和條件；

(2)如果需要另建新的測(cè)定系統(tǒng)，那么就得先對(duì)該酶的作用、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等有所了解，據(jù)此來(lái)選擇合適的底物和底物濃度、以及最適的反應(yīng)pH和溫度等，同時(shí)確定一種相應(yīng)的測(cè)定方法。測(cè)酶活時(shí)的注意事項(xiàng):

一是測(cè)定用的酶反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇在酶反應(yīng)的初速度范圍內(nèi)；二是測(cè)定用的酶量必須和測(cè)得的活性有線性關(guān)系。

純化過(guò)程中的酶活力測(cè)定還應(yīng)考慮三個(gè)問(wèn)題：

(1)由于測(cè)定工作量校大，而且有時(shí)“立等”結(jié)果，所以要求測(cè)定方法快速、簡(jiǎn)便，而準(zhǔn)確度在一定程度上比較次要，甚至可容許5—10％的誤差，故常用分光光度法、電學(xué)測(cè)定法等測(cè)定;(2)由于分離純化過(guò)程可能丟失輔助因子，因此有時(shí)需要在反應(yīng)系統(tǒng)中加入相應(yīng)的物質(zhì)，如煮沸過(guò)的抽提液、輔酶、鹽或半脫氨酸等；

(3)由于純化過(guò)程中引入的某些物質(zhì)可能對(duì)酶的反應(yīng)和測(cè)定有影響或干擾，故有時(shí)還應(yīng)在測(cè)定前進(jìn)行透析或加入螯合劑等。

測(cè)定酶活力的表示方法:

酶的活力通常采用國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的單位表示，但是在純化工作中，為了方便，也可采用自行規(guī)定的單位，如直接以光密度值表示.從酶的活力測(cè)定得到的直接結(jié)果是樣品中酶的濃度，即單位數(shù)／毫升。由此進(jìn)一步算出樣品中總的單位數(shù)，即總活力;以及單位重量的蛋白質(zhì)中酶的單位數(shù)，即比活力，如單位數(shù)／毫克蛋白，或單位數(shù)／毫克蛋白氮。

測(cè)蛋白含量常用的方法有：

(1)紫外吸收法，此法簡(jiǎn)便快速，不損耗樣品，但干擾因素很多；

(2)雙縮脲法,較簡(jiǎn)單；

(3)酚試劑法,較復(fù)雜，但靈敏度、準(zhǔn)確度都比較高。

(4)蛋白質(zhì)通常采用凱氏定氮法。一般比活力愈高，酶的純度也較好，但是它不能說(shuō)明實(shí)際的純凈程度是多少。

（二）純化方法與條件的比較標(biāo)準(zhǔn)在酶的分離工作中，總活力用于計(jì)算某一抽提或純化步驟后酶的得率或回收率(y)；比活力則用于計(jì)算某一純化步驟的純化效果，即純度的提高(e)。y(收率)=——————————某步驟前的總活力某步驟后的總活力e(純度提高)=——————————某步驟前的比活力某步驟后的比活力

抽提或純化某步中，如果有多種方法或條件可供選擇時(shí)，一般采用下式進(jìn)行權(quán)衡：

loge＝logE·logy／logYe和y分別表示用某種方法或條件進(jìn)行一次純化后純度的提高與回收率；G和Y分別表示用上述方法或條件重復(fù)多次后總的純度提高與總的回收率，這兩項(xiàng)是推算出來(lái)的。

例如，有A、B二種方法或條件可供選擇，用A法重復(fù)n次以后可得到Ea和Ya；以Ea為標(biāo)準(zhǔn)，用B法要得到同樣的Ea，需要重復(fù)n次，由此就可算出相應(yīng)的Yb．比較Ya和Yb就能作出判斷。

三純度的標(biāo)準(zhǔn)純度提高和回收率的鑒定能幫助我們選擇純化方法與純化條件。但是經(jīng)過(guò)一定的純化步驟后，為了了解所獲得的樣品是否均一純凈還要進(jìn)行純度鑒定。酶均一純凈性的鑒定有以下幾種方法:1．溶解度法這是老方法，由于所需樣品量較大，已很少采用．2.電泳法常用的有醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺不連續(xù)膠電泳和聚焦膠電泳，特別是后二者有極高的分辨力。3.超離心法

在高達(dá)65，000rpm的離心力場(chǎng)情況下觀測(cè)離心譜帶，根據(jù)沉降峰帶是否分裂、是否有“肩”、是否對(duì)稱(chēng)等可以作出均一與否的判斷。4．免疫學(xué)法純化的酶樣品在瓊脂膠上與相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，根據(jù)得到的沉降線可以判斷樣品的純度。如果此法以免疫電泳的方式進(jìn)行，則更為靈敏。第四節(jié)酶的劑型與保存為適應(yīng)各種需要，并考慮到經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用效果，酶制劑常以四種劑型供應(yīng)：

1.液體酶制劑

2.固體粗酶制劑

3.純酶制劑

4.固定化酶制劑

一.液體酶制劑制備與應(yīng)用:

這包括稀酶液和濃縮酶液。一般在除去菌體等雜質(zhì)后，不再純化而直接制成或加以濃縮。只適于就近的某些工業(yè)部門(mén)如紡織工業(yè)等直接應(yīng)用．特點(diǎn):

比較經(jīng)濟(jì)，但不穩(wěn)定，而且成份繁雜.

二.固體粗酶制劑

制備與應(yīng)用:

這類(lèi)制劑有的是發(fā)酵液經(jīng)過(guò)殺菌后直接濃縮干燥制成；有的是發(fā)酵液濾去菌體后噴霧干燥制成;有的則加材淀粉等填充料。這些制劑多用于皮革軟化脫毛、水解纖維素等方面。這類(lèi)制劑中也有的是在發(fā)酵液或抽提液除去雜質(zhì)，并經(jīng)初步純化后制成，如用于洗滌劑、藥物等生產(chǎn)的酶制劑。

特點(diǎn):

固體粗酶制劑便于運(yùn)輸和短期保存，成本也不高。

三.純酶制劑

用途:包括結(jié)晶酶在內(nèi)，通常用作分析試劑或用作醫(yī)療藥物，要求有較高的純度。用作分析工具酶時(shí)，除了要求沒(méi)有干擾作用的雜酶存在外，還要求單位重量的酶制劑中酶活性達(dá)到一定單位數(shù)。用作基因工程的工具酶則要求不含非專(zhuān)一性的核酸酶，或完全不含核酸酶。作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析對(duì)象的酶必須“絕對(duì)”純凈，而注射用的醫(yī)用酶則應(yīng)設(shè)法除去熱源類(lèi)物質(zhì)。

熱源類(lèi)物質(zhì)：定義:是染菌后細(xì)菌分泌出來(lái)的一類(lèi)類(lèi)毒素，帶有這類(lèi)物質(zhì)的制劑注射到動(dòng)物體后，能引起體溫升高。熱源物質(zhì)屬于糖蛋白，分子量在十萬(wàn)以上，因細(xì)菌來(lái)源不同有小的差異。

特點(diǎn):熱源物質(zhì)對(duì)熱相當(dāng)穩(wěn)定，往往要通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高溫作用，例如180-220℃，二小時(shí)以上的處理才會(huì)分解；同時(shí)很耐酸，不過(guò)在堿中，例如pH＞10，四十八小時(shí)的作用下會(huì)逐漸破壞；熱源物質(zhì)對(duì)氧化劑十分敏感，在新鮮配制