第八章微生物監(jiān)測(cè)環(huán)境

第八章微生物監(jiān)測(cè)環(huán)境第一節(jié)環(huán)境污染的指示微生物第二節(jié)污染物生物毒性的微生物學(xué)檢測(cè)方法第三節(jié)污染物致突變性的微生物檢測(cè)方法一、一般污染指示微生物指示微生物：在常規(guī)環(huán)境監(jiān)測(cè)中，用以指示環(huán)境樣品污染性質(zhì)與程度，并評(píng)價(jià)環(huán)境衛(wèi)生狀況的具有代表性的微生物。（一）細(xì)菌總數(shù)1、定義：環(huán)境中被測(cè)樣品在一定條件下培養(yǎng)后所得的1mL或1g檢樣中所含有的細(xì)菌菌落總數(shù)。反映環(huán)境中異養(yǎng)型細(xì)菌的污染從度，也間接反映一般營(yíng)養(yǎng)性有機(jī)物的污染程度。2、方法（1）液態(tài)與固態(tài)對(duì)象中的細(xì)菌總數(shù)：

將經(jīng)過(guò)一定倍數(shù)稀釋的樣品懸液，定量接種（傾注或圖布）于營(yíng)養(yǎng)平板，有氧37℃培養(yǎng)48h后觀(guān)察菌落。（2）空氣中的細(xì)菌總數(shù)：平板暴露沉降法采用直徑9cm平皿在1.2m高處暴露5min，培養(yǎng)計(jì)數(shù)；奧氏公式：5min內(nèi)落在100cm2營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的細(xì)菌數(shù)和10L空氣中所含的細(xì)菌數(shù)相同最小采樣量和最小沉降面積（為避免出現(xiàn)“0”粒的概率，確保結(jié)果可靠性）。儀器法采用固體撞擊式采樣器。C=1000×50NA×tC－空氣細(xì)菌數(shù)A－捕集面積，cm2t－暴露時(shí)間，minN－菌落數(shù)，個(gè)菌落計(jì)算方法有效菌落：無(wú)片狀菌落的平皿；若片狀菌落不到培養(yǎng)皿一半，而另一半分布又均勻，可以半皿計(jì)數(shù)再乘2代表全皿；選擇平均菌落數(shù)在30～300之間進(jìn)行計(jì)算；若有兩個(gè)稀釋度的平均符合，按兩者菌落總數(shù)之比來(lái)決定，<2報(bào)告平均數(shù)，>2則報(bào)告較少的菌落總數(shù)；若均大于300（小于30），按稀釋度最高（低）的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；若所有稀釋度均不在30～300之間，則以最接近的報(bào)告。報(bào)告方式：<100報(bào)告實(shí)有數(shù)字；>100采用兩位有效數(shù)字，余者四舍五入；無(wú)法計(jì)算時(shí)，注明稀釋倍數(shù)結(jié)果：cfu/ml或cfu/g細(xì)菌總數(shù)的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)生活飲用水<100cfu/ml室內(nèi)空氣<500～1000/m3室內(nèi)空氣指示菌以咽喉正常菌叢中的綠色鏈球菌為最合適，在上呼吸道和空氣中較易發(fā)現(xiàn)。對(duì)方法的評(píng)價(jià)：相對(duì)性無(wú)菌水1.

稀釋平板計(jì)數(shù)法—固體培養(yǎng)法第一步：菌樣巧妙稀釋得到不同稀釋度（10-x）菌液菌樣被無(wú)菌水不同稀釋倍率后平板培養(yǎng)圖

10-2

10-3

10-4

10-5

各取1ml，均勻涂布于冷固體培養(yǎng)基平板上或與溫?zé)嵋簯B(tài)固體培養(yǎng)基混合冷卻。第三步：培養(yǎng)稀釋度過(guò)低，菌落密集無(wú)法計(jì)數(shù)可以計(jì)數(shù)，但數(shù)量過(guò)多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力數(shù)量合適，統(tǒng)計(jì)計(jì)算，作為結(jié)果數(shù)量太少，誤差因素太大，不做計(jì)數(shù)第二步：接種平板每一個(gè)細(xì)菌會(huì)生成一個(gè)菌落一般計(jì)數(shù)平板的細(xì)菌生長(zhǎng)菌落數(shù)以30~300個(gè)為宜。第四步：計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量=？細(xì)菌數(shù)量=數(shù)出的菌落數(shù)/稀釋度例如：10-5稀釋度時(shí)菌落數(shù)為125個(gè)細(xì)菌數(shù)量=125/10-5=1.25×107個(gè)/mL

平板計(jì)數(shù)法是采用最廣的一種活菌計(jì)數(shù)法如國(guó)標(biāo)法水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。注意：作空白及取平行樣（2～3組）均值減小誤差平均（二）霉菌和酵母菌總數(shù)意義：偏酸性好氧條件，存活力強(qiáng)，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物廣泛；反映環(huán)境的一般性污染。方法：虎紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等；傾注平板法；25-28℃3-5天。結(jié)果：cfu/ml或cfu/g衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：方法評(píng)價(jià)：主要適用于霉菌，酵母菌附帶生長(zhǎng)，均非環(huán)境中全部酵母菌。二、糞便污染指示菌（一）糞便污染指示菌的理想條件：是人畜糞便中的正常菌，且數(shù)量較糞便中其他菌為多受人畜糞便污染的環(huán)境中可檢出，而未受污染環(huán)境無(wú)該菌存在排出至環(huán)境后，該菌存活時(shí)間與腸道致病菌相當(dāng)或略長(zhǎng)對(duì)氯等消毒劑及其他不良因素的抵抗力略強(qiáng)于腸道致病菌檢出與鑒定方法比較簡(jiǎn)便迅速（二）總大腸菌群是一群能在37℃，24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的G-無(wú)芽孢桿菌；主要包括四個(gè)菌屬：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬；方法：多管發(fā)酵法、濾膜法。不適于用大腸菌群作為糞便污染指示菌的食品冷凍食品經(jīng)射線(xiàn)照射處理的食品

pH較高的食品在上述食品中大腸菌群的細(xì)菌比許多腸道病原微生物更易死亡1、多管發(fā)酵法初發(fā)酵：在2個(gè)各裝有已滅菌的50mL濃乳糖蛋白胨的大發(fā)酵瓶中，無(wú)菌操作加入水樣100mL；在10只含5mL培養(yǎng)基的發(fā)酵管中加水樣10mL，混勻后37℃培養(yǎng)24h；如無(wú)酸及氣體產(chǎn)生，為“－”；如有酸和氣體，或無(wú)氣體但有酸產(chǎn)生，為“＋”；如有氣體產(chǎn)生，但沒(méi)產(chǎn)酸，溶液也不渾濁，可能是操作技術(shù)問(wèn)題，須重作檢驗(yàn)；平板分離：從陽(yáng)性管中取液，分別接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，注意編號(hào)，

37℃培養(yǎng)24h。多管發(fā)酵法如無(wú)細(xì)菌增殖現(xiàn)象，為“－”；如僅發(fā)現(xiàn)芒狀、霉?fàn)罨蚱渌麩o(wú)關(guān)菌屬的菌落，為“－”；挑取符合下列特征的菌落1/3涂片、G染色、鏡檢；品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基：紫紅色，具金屬光澤；深紅色，不帶或略帶金屬光澤；淡紅中心色較深；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：深紫黑色，具金屬光澤；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色，中心色較深。多管發(fā)酵法復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：挑取鏡檢G-無(wú)芽孢桿菌的其余部分菌落，接種于含10mL普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24h，觀(guān)察產(chǎn)酸產(chǎn)氣；根據(jù)復(fù)發(fā)酵結(jié)果，統(tǒng)計(jì)出陽(yáng)性管及瓶數(shù)，查表得出總大腸菌群數(shù)。多管發(fā)酵法水源水檢驗(yàn)時(shí)水樣稀釋10倍，預(yù)備15支發(fā)酵管，5支裝5ml濃培養(yǎng)基，加水樣10ml；10支裝10ml普通培養(yǎng)基，5支加水樣1ml，5支加稀釋水樣1ml；以后檢測(cè)同飲用水，根據(jù)存在的陽(yáng)性管數(shù)查另外的檢數(shù)表。濾膜法比發(fā)酵法縮短時(shí)間，有可能在24h內(nèi)完成。孔徑0.45-0.65μm，多孔性硝化纖維膜；濾膜滅菌：蒸餾水煮15min×3次；濾器滅菌：酒精棉球火焰滅菌或121℃30min；過(guò)濾水樣：粗糙面向上，過(guò)濾水量的確定以培養(yǎng)后濾膜上長(zhǎng)出的菌落不多于50個(gè)為原則。濾膜法水樣過(guò)濾后，繼續(xù)抽氣5s關(guān)閉，帶菌濾膜置于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，二者之間不得留有氣泡，37℃培養(yǎng)24h；挑取特征菌落染色鏡檢；G-無(wú)芽孢桿菌的穿刺接種到乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基（預(yù)先煮沸排氣），37℃培養(yǎng)6～8h，產(chǎn)氣者為“＋”，培養(yǎng)基內(nèi)部形成龜裂狀，甚至部分上??；結(jié)果與衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：大腸菌群數(shù)（個(gè)/L或個(gè)/ml）；飲用水標(biāo)準(zhǔn)：0個(gè)/100ml，土壤<100個(gè)/g大腸菌群值：水樣中可檢出1個(gè)大腸菌群細(xì)菌的最小水樣容積；土壤>10-2方法評(píng)價(jià)：發(fā)酵法耗時(shí)長(zhǎng)、濾膜法不適于混濁度高的水樣、結(jié)果可能不準(zhǔn)確、不能指示水中細(xì)菌；來(lái)源不單一；不能指示病毒新進(jìn)展：“大腸菌群產(chǎn)色基質(zhì)試驗(yàn)”兩個(gè)活性底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷及4－甲基傘形酮基-β-D葡萄糖醛酸，分別被大腸菌群的β－半乳糖苷酶和大腸桿菌的β－葡萄糖醛酸酶分解產(chǎn)生黃色的鄰硝基苯和發(fā)熒光的化合物，24h即可完成糞大腸菌群能在44.5℃發(fā)酵乳糖的大腸菌群，亦稱(chēng)耐熱性大腸菌群。糞大腸菌群與糞便中大腸桿菌數(shù)直接相關(guān)，且在外環(huán)境中不易繁殖，因此意義更大。方法：多管發(fā)酵法、濾膜法EC培養(yǎng)基：三號(hào)膽鹽、胰蛋白胨、乳糖M-TEC培養(yǎng)基：眎蛋白胨、酵母膏、乳糖、十二烷基磺酸鈉、脫氧膽鹽鈉、溴甲酚紫、溴酚紅等糞大腸菌群結(jié)果：同總大腸菌群衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：方法評(píng)價(jià)：是種較好的水中腸道致病菌的指示菌糞鏈球菌意義：在人糞便中數(shù)量?jī)H次于大腸菌群細(xì)菌在水中不會(huì)自行繁殖，但抵抗力弱于致病菌為水質(zhì)細(xì)菌學(xué)評(píng)價(jià)提供有意義的補(bǔ)充材料根據(jù)Fe/Fs（糞大腸菌群/糞鏈球菌）∮來(lái)推測(cè)糞便污染的來(lái)源，僅適于新鮮污染方法：多管發(fā)酵法、濾膜法Fe/Fs≥4，認(rèn)為污染主要來(lái)自于人糞；≤0.7，主要來(lái)自溫血?jiǎng)游锛S便<4而>2，混合污染以人糞為主<1而>0.7，混合污染以動(dòng)物糞便為主產(chǎn)氣莢膜梭菌∮意義：存在于人及溫血?jiǎng)游锛S便中，具有芽孢的厭氧桿菌；具有較強(qiáng)抵抗力，特別適用于含有毒物質(zhì)的水體方法：多管發(fā)酵法、濾膜法、傾注法蛭弧菌∮意義：天然寄生菌，對(duì)污染的指示滯后，其指示污染可彌補(bǔ)大腸菌群的不足。方法：自來(lái)水雙層瓊脂平板法產(chǎn)氣莢膜梭菌蛭弧菌第三節(jié)其他指示微生物致病菌的指示菌沙門(mén)氏菌志賀氏菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌鏈球菌破傷風(fēng)梭菌腸炎沙門(mén)氏菌志賀氏菌銅綠假單胞菌產(chǎn)色素的銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌鏈球菌破傷風(fēng)梭菌腸道病毒的指示微生物脊髓灰質(zhì)炎病毒選用理由：脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株對(duì)環(huán)境壓力相對(duì)穩(wěn)定，抵抗力較其它病毒強(qiáng)，操作相對(duì)安全，與其他病毒比較易從環(huán)境樣品中檢測(cè)到濃縮方法：濾膜法、氫氧化鋁吸附沉淀法、聚乙二醇脫水透析法檢測(cè)方法：蝕斑實(shí)驗(yàn)、免疫學(xué)法噬菌體f2選用理由：與腸道病毒基本性狀相似，核酸均為RNA，理化性質(zhì)相近；存在于人類(lèi)糞便中，在水和污水中存在的數(shù)目多于腸道病毒；對(duì)外環(huán)境和氯的耐受力與腸道病毒相似或稍強(qiáng)；檢測(cè)方法簡(jiǎn)單檢測(cè)方法：空斑定量測(cè)定法不足之處：在人糞便中數(shù)量不多；DNA大腸桿菌噬菌體在人類(lèi)糞便中經(jīng)常存在，并可能在水環(huán)境中繁殖，易掩蓋或混淆。作為腸道病毒污染指標(biāo)不理想，可作為消毒效果評(píng)價(jià)指標(biāo)第二節(jié)

污染物生物毒性的微生物學(xué)檢測(cè)方法

一、原核微生物檢測(cè)法發(fā)光細(xì)菌——細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)細(xì)菌發(fā)光的生物學(xué)機(jī)制：NADH2FMN細(xì)胞色素O2蟲(chóng)熒光色素酶O2，醛激活的蟲(chóng)熒光色素酶蟲(chóng)熒光色素酶+光（一）細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)試驗(yàn)原理環(huán)境條件不良或有毒物存在時(shí)，因細(xì)菌熒光素酶活性或細(xì)胞呼吸受到抑制，發(fā)光能力受影響而減弱，其減弱程度與毒物的毒性大小和濃度成一定比例關(guān)系常用明亮發(fā)光桿菌“Microtox”法，是目前國(guó)際通用、使用最為廣泛的污染物毒性微生物學(xué)檢測(cè)方法細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)試驗(yàn)方法菌種復(fù)蘇：加入2％NaCl，穩(wěn)定1～2h樣品處理：樣品稀釋并調(diào)pH6~8，同時(shí)調(diào)溶液的滲透壓使之含2％NaCl。毒性測(cè)定：定量加入菌液和樣品，15℃培養(yǎng)5或10min，直接讀出光量抑制百分率求不同劑量及其IR之間的回歸方程，計(jì)算IC50凍干菌種：白色粉末狀，含4％發(fā)光菌細(xì)胞，2％NaCl，保護(hù)劑和緩沖物質(zhì)，－20～－25℃?zhèn)溆?，有效期一年IR＝陰性對(duì)準(zhǔn)組指標(biāo)值－實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)值陰性對(duì)準(zhǔn)組指標(biāo)值×100％陽(yáng)性有機(jī)對(duì)照－苯酚陽(yáng)性無(wú)機(jī)對(duì)照－Zn2+陰性對(duì)照－蒸餾水細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)質(zhì)量控制同一劑量平行測(cè)定管間的發(fā)光強(qiáng)度差異值應(yīng)<20％100mg/L苯酚的IC50,5min應(yīng)為13～26mg/L100mg/LZnSO4?7H2O的IC50,15min應(yīng)為3～10mg/L 細(xì)菌生物發(fā)光抑制試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)與傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)96h毒性試驗(yàn)有良好的一致性靈敏、快速，自動(dòng)化程度高各實(shí)驗(yàn)室間重現(xiàn)性好，變異系數(shù)10～20％，明顯好于傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)96h毒性試驗(yàn)?zāi)壳啊癕icrotox”已有效地應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)的定量構(gòu)效關(guān)系研究（二）硝化細(xì)菌——硝化作用抑制試驗(yàn)試驗(yàn)原理毒物抑制硝化作用的酶類(lèi)導(dǎo)致亞硝化或硝化細(xì)菌對(duì)底物的利用能力或產(chǎn)物生產(chǎn)量下降。通過(guò)測(cè)量底物或產(chǎn)物的變化來(lái)檢測(cè)污染物毒性作用的程度試驗(yàn)方法：方法評(píng)價(jià)：靈敏度與“Microtox”相當(dāng)，但結(jié)果相關(guān)性較差菌種增至108個(gè)/ml定量加入菌液、NaNO2溶液、不同濃度樣品，蒸餾水做對(duì)照30℃培養(yǎng)4h，定時(shí)取樣分析NO2-含量隨時(shí)間變化，得出硝化作用強(qiáng)度比較樣品組與對(duì)照組，可得IC50二、真核微生物檢測(cè)法（一）藻類(lèi)——生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)試驗(yàn)原理：常用硅藻、柵藻、小球藻等，生長(zhǎng)迅速，對(duì)水質(zhì)變化敏感，通過(guò)測(cè)定其生長(zhǎng)量來(lái)反應(yīng)水質(zhì)污染情況或物質(zhì)毒性程度試驗(yàn)方法：藻體生長(zhǎng)量；釋出氧量；攝取14C量；細(xì)胞DNA及ATP測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)：藻細(xì)胞最大生長(zhǎng)速率與對(duì)照相比降至50％以下，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，即可認(rèn)為受試物有毒性作用（二）原生動(dòng)物——微尺度群落級(jí)毒性試驗(yàn)試驗(yàn)原理：在正常條件下自然界水環(huán)境的微型生物群落種類(lèi)、分布與構(gòu)成均有一定規(guī)律。在外界環(huán)境因素的干擾下，群落的平衡被破壞，結(jié)構(gòu)特征也隨之變化。通過(guò)分析相關(guān)的微型生物群落結(jié)構(gòu)參數(shù)，即可判斷水環(huán)境的質(zhì)量狀況或污染物質(zhì)的毒性特征。具有很強(qiáng)的生態(tài)學(xué)意義。原生動(dòng)物——微尺度群落級(jí)毒性試驗(yàn)聚氨酯泡沫塑料塊（PFU）法作為微型動(dòng)物的生態(tài)島，其上原生動(dòng)物群集速度隨種類(lèi)上升而下降，兩者交叉點(diǎn)及為平衡點(diǎn)，達(dá)到平衡時(shí)間取決于環(huán)境條件據(jù)報(bào)道：孔徑100～150μm，厚度5cm，規(guī)格5×6.5×7.5cm3為好，可依靠垂墜物懸掛在任何水層據(jù)報(bào)道：其擠出液可見(jiàn)到水體中大約85％的原生動(dòng)物種類(lèi)，可以反映整個(gè)群落動(dòng)態(tài)變化的全過(guò)程和基本趨勢(shì)原生動(dòng)物——微尺度群落級(jí)毒性試驗(yàn)試驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)：一般情況下，隨著污染程度的升高，原生動(dòng)物種類(lèi)數(shù)（S）會(huì)減少，多樣性指數(shù)（d）會(huì)降低，Seq會(huì)下降；在一個(gè)以異養(yǎng)型生物為主的水體中，異養(yǎng)型指數(shù)（HI）高，表示存在有機(jī)污染，此時(shí)群集速度常數(shù)（G）會(huì)增大，T90會(huì)縮短三、活性污泥毒性檢測(cè)法脫氫酶活性試驗(yàn)試驗(yàn)原理：活性污泥中微生物的脫氫酶類(lèi)能使被氧化有機(jī)質(zhì)的氫原子活化并傳遞給特定的氫受體，反映活性污泥對(duì)污水中有機(jī)質(zhì)的氧化分解能力。毒性物質(zhì)的存在會(huì)抑制脫氫酶的活性，可通過(guò)指示劑的還原變色速度來(lái)確定脫氫酶的活性，以判斷毒性物質(zhì)的作用強(qiáng)度。常用指示劑為T(mén)TC（氯化三苯基四氮唑），它受氫后變?yōu)榧t色TF（三苯基甲臜）（485nm）脫氫酶活性試驗(yàn)試驗(yàn)方法：TF標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作馴化的活性污泥經(jīng)離心洗滌制成懸浮液在測(cè)定管中定量加入懸浮液、Tris-HCl緩沖液、樣品、TTC等，以蒸餾水做對(duì)照37℃水浴避光反應(yīng)顯色，加濃硫酸終止加入丙酮萃取TF，離心上清液485nm比色，得TF產(chǎn)生量，計(jì)算脫氫酶活性酶活：指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，衡量標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度的大小，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)生生成量來(lái)表示呼吸抑制試驗(yàn)試驗(yàn)原理：廢水中有毒物質(zhì)可以抑制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2產(chǎn)生量下降，下降的程度與毒性物質(zhì)的濃度和強(qiáng)度有關(guān)試驗(yàn)方法：傳統(tǒng)的瓦勃氏呼吸儀法和目前的直接測(cè)定DO法結(jié)果評(píng)價(jià)：相對(duì)好氧速率＝污泥的呼吸耗氧速率內(nèi)源性呼吸耗氧速率×100％四、微生物學(xué)檢測(cè)法評(píng)價(jià)簡(jiǎn)便靈敏快速經(jīng)濟(jì)結(jié)果的差異性結(jié)果的變異性與哺乳動(dòng)物試驗(yàn)互為補(bǔ)充第三節(jié)

污染物致突變性的微生物檢測(cè)方法一、基因突變?cè)囼?yàn)二、DNA損傷修復(fù)試驗(yàn)三、DNA重組試驗(yàn)四、微生物致突變?cè)囼?yàn)與致癌物的確定一、基因突變?cè)囼?yàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）應(yīng)用與評(píng)價(jià)：良好的環(huán)境致突變物與潛在致癌物初篩報(bào)警Ames試驗(yàn)已被我國(guó)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序、農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法、新藥（西藥）毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則、化妝品安全性評(píng)價(jià)程序和方法、食品功能毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法等列為評(píng)價(jià)致突變性的必做試驗(yàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）原理：人工誘變的鼠傷寒沙門(mén)氏菌株，又稱(chēng)TA（his）菌株，是組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，在致突變物的作用下，能發(fā)生回復(fù)突變?yōu)橐吧透鶕?jù)該菌在特殊培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)能力，判斷受試物是否具有致突變性哺乳動(dòng)物肝勻漿中含微粒體混合功能氧化酶，對(duì)間接致突變物有生物活化作用鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）常用菌株：TA97、TA98、TA100、TA102①組氨酸依賴(lài)性，+表示需要②深粗糙型脂多糖屏障丟失，+表示缺失，有抑菌③紫外線(xiàn)損傷修復(fù)基因缺陷，+表示缺失，無(wú)修復(fù)能力④抗氨芐青霉素因子，+表示有⑤抗四環(huán)素質(zhì)粒，+表示有鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：菌株選擇：TA97、TA98、TA100、TA102溶劑選擇：根據(jù)受試物的理化性質(zhì)，水溶性的最好用滅菌雙蒸水，非水溶的一般常用二甲基亞砜（DMSO），每皿有機(jī)溶劑用量不得超過(guò)0.1ml鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）劑量選擇：在0.2~500μg/皿之間選擇2或3個(gè)劑量，常用為0.2、2、20、500μg/皿。有殺菌作用的包括一個(gè)最低殺菌濃度，有沉淀的包括一個(gè)最小沉淀濃度，誘變陰性的包括一個(gè)最大溶解濃度，無(wú)殺菌作用的最高檢測(cè)濃度至少應(yīng)為500μg/皿。受試溶液應(yīng)新鮮配制陽(yáng)性對(duì)照物的選擇：必須同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照，用以檢定菌株的回變性和特異性以及S-9混合液的效果鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）試驗(yàn)設(shè)計(jì)的嚴(yán)密性：受試物最少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量，以便觀(guān)察劑量反應(yīng)關(guān)系，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和溶劑對(duì)照。陰性對(duì)照可反應(yīng)菌株的自發(fā)回變情況，溶劑對(duì)照可排除溶劑引起突變的可能性。同一樣品必須做加S-9混合液和不加S-9混合液的試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)，每份樣品（包括對(duì)照）均應(yīng)做三個(gè)平行樣，至少應(yīng)做2次重復(fù)試驗(yàn)，方可正式報(bào)告結(jié)果鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）培養(yǎng)基：S-9液取材：選用200g左右、健康雄性Sprague-Dawley系大鼠或150g左右、健康雄性Wister大鼠。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（增菌用）：含牛肉膏、蛋白胨Vogel-Bonner氏液：含多種無(wú)機(jī)鹽底層瓊脂（供細(xì)菌生長(zhǎng)）：含V-B液、葡萄糖頂層瓊脂（致突變?cè)囼?yàn)）：含生物素、組氨酸鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）營(yíng)養(yǎng)瓊脂（鑒定菌株特性）氨芐青霉素平皿（鑒定R因子）：含V-B液、葡萄糖、生物素、組氨酸、氨芐青霉素組氨酸/生物素平皿（鑒定His）：含V-B液、葡萄糖、生物素、組氨酸Master平板（短期保存菌種）：含V-B液、葡萄糖、生物素、組氨酸、氨芐青霉素鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）試驗(yàn)方法：紙片點(diǎn)試法：定性試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)：如果僅在平板上出現(xiàn)少量的散的菌落認(rèn)為是陰性致突變物。如果浸有受試物的紙片周?chē)L(zhǎng)出較多密集的回變菌落與空白對(duì)照有明顯區(qū)別者，可判定該受試物為陽(yáng)性致突變物紙片周?chē)刈兙鋽?shù)<20，為“-”紙片周?chē)刈兙鋽?shù)<100，為“+”紙片周?chē)刈兙鋽?shù)<200，為“++”紙片周?chē)刈兙鋽?shù)<500，為“+++”紙片周?chē)刈兙鋽?shù)>500，為“++++”鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）平皿滲入法：定量試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)：陽(yáng)性結(jié)果的判斷：滲入試驗(yàn)必須同時(shí)獲得下列結(jié)果，才能確定測(cè)試物為陽(yáng)性致突變物背景菌落生長(zhǎng)良好測(cè)試皿回變菌落數(shù)比對(duì)照皿回變菌落數(shù)增加2倍以上有劑量反應(yīng)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果有重現(xiàn)性鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）陰性結(jié)果的判斷：滲入試驗(yàn)必須同時(shí)獲得下列結(jié)果，才能確定測(cè)試物為陰性致突變物對(duì)于純化學(xué)受試物，當(dāng)試驗(yàn)濃度達(dá)500μg/皿（或?qū)y(cè)試菌株最大無(wú)抑制用劑量）仍未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果者，±S-9試驗(yàn)結(jié)果陰性不同菌株試驗(yàn)結(jié)果均為陰性重復(fù)檢驗(yàn)也均為陰性鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）注意事項(xiàng)無(wú)菌操作。本試驗(yàn)全部操作必須嚴(yán)格無(wú)菌，所使用的溶液、培養(yǎng)基、器材等必須經(jīng)過(guò)滅菌，以防其它細(xì)菌或霉菌污染測(cè)試菌株的菌液必須是新培養(yǎng)的新鮮菌液，每ml活菌數(shù)不得少于2×108個(gè)。菌株在使用前應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)中所用的陽(yáng)性對(duì)照物對(duì)人體有害，操作時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)應(yīng)有良好的、具通風(fēng)換氣設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）注意事項(xiàng)一切帶有測(cè)試菌的器皿，用后立即高壓滅菌，若來(lái)不及滅菌則放在加蓋容器內(nèi)，嚴(yán)防任何小動(dòng)物特別是老鼠接觸所用有機(jī)溶液必須重新蒸餾。低溫蒸餾必須用水浴及專(zhuān)用蒸餾器，并在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)防明火接觸，以免發(fā)生火災(zāi)使用的蒸餾水必須是重蒸水。配試劑及培養(yǎng)基要用新蒸的蒸餾水，保證一切溶劑無(wú)致突變物污染。所有器皿最后也應(yīng)用新蒸出的蒸餾水洗凈發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)原理：發(fā)光細(xì)菌的自發(fā)暗變異株與致突變物接觸后，可恢復(fù)一定強(qiáng)度的發(fā)光能力。應(yīng)用與評(píng)價(jià)：與Ames試驗(yàn)檢測(cè)遺傳毒性物質(zhì)所反應(yīng)的遺傳毒性水平具有較好的一致性；美國(guó)Microbics公司標(biāo)準(zhǔn)化方法“Mutatox”發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)方法：步驟：菌株復(fù)蘇→增菌→分裝→20℃振蕩24h→開(kāi)始測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度（每隔3~4h）結(jié)果判定：待測(cè)樣品管發(fā)光強(qiáng)度是對(duì)照管3倍為陽(yáng)性結(jié)果；樣品管5個(gè)平行系列中陽(yáng)性結(jié)果≥3，待測(cè)物具致突變性；不足3個(gè)為可疑；無(wú)陽(yáng)性結(jié)果可認(rèn)為不具有致突變性其他基因突變?cè)囼?yàn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株回復(fù)突變?cè)囼?yàn)：類(lèi)似于Ames試驗(yàn)細(xì)菌的正向突變?cè)囼?yàn)：正向突變比回復(fù)突變的DNA有更多位點(diǎn)可以發(fā)生突變，可以檢測(cè)更為廣泛的化合物粗糙脈孢菌的正向突變?cè)囼?yàn)：真核真菌，用于檢測(cè)基因的正向和回復(fù)突變構(gòu)巢曲霉的突變?cè)囼?yàn)：第二節(jié)DNA損傷修復(fù)試驗(yàn)SOS顯色試驗(yàn)SOS修復(fù)：“易錯(cuò)性DNA修復(fù)”，靠這種修復(fù)形成的DNA聚合酶由于識(shí)別堿基的精確性低，易造成復(fù)制的差錯(cuò)，進(jìn)而引起突變?cè)恚褐峦蛔円蛩刈饔糜贒NA產(chǎn)生的某些損傷可誘導(dǎo)細(xì)菌SOS修復(fù)系統(tǒng)的反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)SOS修復(fù)的能力來(lái)查明理化因素是否具有致突變、致癌的特性；可用特定菌株分解特定物質(zhì)產(chǎn)生色素來(lái)反應(yīng)其中酶的合成水平∮β-半乳糖苷酶分解Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和β－ONPG（鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷），分別產(chǎn)生藍(lán)色不溶性色素和黃色可溶性色素SOS顯色試驗(yàn)方法：檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞原發(fā)直接的SOS反應(yīng)，即用產(chǎn)色底物來(lái)監(jiān)測(cè)大腸桿菌SOS修復(fù)反應(yīng)；紙片法定性，液體法定量應(yīng)用與評(píng)價(jià)：與Ames的敏感性、準(zhǔn)確性相當(dāng)，且操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、方便、不受測(cè)試菌株存活數(shù)的影響；可將二者互為補(bǔ)充共同作為研究遺傳毒物的初篩試驗(yàn)聚合酶缺陷型菌株試驗(yàn)原理：多數(shù)致癌物質(zhì)可與DNA結(jié)合使之發(fā)生一定的改變和損傷，而微生物具有修復(fù)DNA的功能；將同一受試物作用于具有修復(fù)能力的野生型菌株和缺乏修復(fù)能力的變異株，則微生物的生長(zhǎng)可能出現(xiàn)差異；聚合酶缺陷型菌株DNA受損后即不能修復(fù)，細(xì)菌無(wú)法生存聚合酶缺陷型菌株試驗(yàn)菌株：E.coli

P3478（polA-）和E.coli

W3110（polA+）方法：點(diǎn)試法比較抑菌圈或劃線(xiàn)接種帶應(yīng)用與評(píng)價(jià)：只對(duì)具有直接致突變作用的烷化物較為敏感對(duì)需要代謝活化的化合物如芳香胺、多環(huán)烴等不敏感，加肝勻漿活化系統(tǒng)亦效果不佳在液體培養(yǎng)基中測(cè)定對(duì)某些原致癌物檢出率有所提高重組缺陷型菌株試驗(yàn)原理：利用檢驗(yàn)重組修復(fù)能力來(lái)判斷致突變性菌株：枯草芽孢桿菌重組缺陷型菌株－Bac.subtilis

M45（recA-）和對(duì)照菌株Bac.subtilis

H17（recA+）方法：點(diǎn)試法比較抑菌圈或劃線(xiàn)接種帶應(yīng)用與評(píng)價(jià)：在無(wú)代謝活化條件下比Ames敏感在有代謝活化條件下檢出率比Ames低溶源性細(xì)菌試驗(yàn)原理：溶源性細(xì)菌細(xì)胞受到某些誘變劑作用時(shí)，產(chǎn)生SOS修復(fù)，使菌體內(nèi)原噬菌體活躍起來(lái)，在菌體內(nèi)大量繁殖，使細(xì)菌發(fā)生裂解而釋放；在固體培養(yǎng)基上裂解非溶源性細(xì)菌形成噬菌斑菌株：溶源性E.coli

K12（λ）和非溶源性E.coli

K12（S）方法：將兩種菌液按一定比例同時(shí)接種于一個(gè)平板，放入受試物過(guò)夜培養(yǎng)觀(guān)察應(yīng)用與評(píng)價(jià)：可用于測(cè)定復(fù)雜混合物的潛在遺傳毒性第三節(jié)DNA重組試驗(yàn)釀酒酵母的有絲分裂基因轉(zhuǎn)變可測(cè)定致突變物質(zhì)所致的缺陷型等位基因的轉(zhuǎn)變異點(diǎn)等位基因二倍體的酵母菌株在其同一基因座位有兩個(gè)不同的缺陷型等位基因，其存在導(dǎo)致一定的營(yíng)養(yǎng)要求在致突變物損傷DNA，導(dǎo)致整個(gè)基因組的有絲分裂重組增強(qiáng)，基因轉(zhuǎn)變隨之發(fā)生，一個(gè)突變型整段轉(zhuǎn)移取代另一突變型等位基因中有缺陷的核苷酸順序，將其中一個(gè)基因恢復(fù)成野生型等位基因第四節(jié)微生物致突變?cè)囼?yàn)與致癌物的確定ICPEMC于1983年提出致突變?cè)囼?yàn)的遺傳學(xué)終點(diǎn)分為5類(lèi)DNA完整性的改變DNA重排或交換DNA堿基序列改變?nèi)旧w完整性改變?nèi)旧w分離改變目前沒(méi)有一種致突變?cè)囼?yàn)?zāi)芎w所有的遺傳學(xué)終點(diǎn)。ICPEMC認(rèn)為需選用一組試驗(yàn)配套進(jìn)行檢測(cè)，包括5種遺傳學(xué)終點(diǎn)。如選用Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、枯草桿菌DNA修復(fù)試驗(yàn)和外周血淋巴細(xì)胞姊妹染色單體互換（SCE）試驗(yàn)4個(gè)項(xiàng)目即可滿(mǎn)足要求第十九章微生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的新發(fā)展第一節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用第二節(jié)微生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用第一節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)與環(huán)境微生物的分類(lèi)、鑒定、監(jiān)測(cè)傳統(tǒng)方法難以及時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)使其偏離原生境，甚至改變可能基因組合多聚酶鏈反應(yīng)核酸雜交技術(shù)核酸多態(tài)性技術(shù)rRNA、rDNA序列分析基因芯片技術(shù)微生物醌指紋法多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗(yàn)原理：模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，在體外擴(kuò)增特異性DNA片段基本要素：模板、引物、原料、DNA聚合酶應(yīng)用：快速、靈敏、簡(jiǎn)便、特異產(chǎn)物可用凝膠電泳定性定量，也可進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化或測(cè)序目前用于環(huán)境細(xì)菌、毒素、病毒及其他微生物的檢測(cè)多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）試驗(yàn)方法模板DNA變性：90~95℃模板DNA分子與引物結(jié)合：45~72℃引物的延伸：72℃上述變性－復(fù)性－延伸稱(chēng)為一個(gè)PCR循環(huán)，DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升實(shí)際反應(yīng)中因引物量減少、原料及酶濃度改變、終產(chǎn)物反饋抑制等原因不能達(dá)到理論值多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸雜交技術(shù)探針：是能與特定核苷酸序列互補(bǔ)、已經(jīng)標(biāo)記的DNA（或RNA