透射電鏡的基本原理

2023/2/3電鏡室1

第一章透射電子顯微鏡的原理與操作

主講:吳金浪2023/2/3電鏡室22023/2/3電鏡室32023/2/3電鏡室42023/2/3電鏡室52023/2/3電鏡室62023/2/3電鏡室72023/2/3電鏡室82023/2/3電鏡室92023/2/3電鏡室102023/2/3電鏡室112023/2/3電鏡室122023/2/3電鏡室132023/2/3電鏡室142023/2/3電鏡室152023/2/3電鏡室162023/2/3電鏡室17一、電子顯微鏡的發(fā)展簡史2023/2/3電鏡室1820世紀(jì)30年代，盧斯卡（E.ruska）發(fā)明了世界上第一臺(tái)透射式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)，并且成功地得到了一張由電子束作為光源形成的銅網(wǎng)放大像。當(dāng)時(shí)放大倍數(shù)僅有12倍。到1934年--電子顯微鏡的分辨率提高到50nm，放大倍數(shù)達(dá)到1萬倍。。

電子顯微鏡的發(fā)展簡史

2023/2/3電鏡室191935年電子顯微鏡基本定型。1939年德國西門子公司生產(chǎn)了世界上第一批作為商品的透射式電子顯微鏡，分辨率優(yōu)于10nm，放大倍數(shù)達(dá)到10萬倍。60年代---透射式電子顯微鏡的分辨率達(dá)到0.5nm。

70年代末--電子顯微鏡的點(diǎn)分辨率已優(yōu)于0.3nm，晶格條紋分辨率達(dá)到0.14nm.

實(shí)現(xiàn)了人們?cè)缇拖蛲膶?duì)原子像和晶格像的觀察。

電子顯微鏡的發(fā)展簡史

2023/2/3電鏡室2080年代--電子顯微鏡已發(fā)展成為一種綜合分析儀器。例如，安裝配有計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的能量分析譜儀，對(duì)樣品進(jìn)行元素的成分分析。樣品室內(nèi)亦可裝配加熱、冷卻、大角度傾斜、拉伸樣品臺(tái)等附件。

電子顯微鏡的發(fā)展簡史

2023/2/3電鏡室21掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope，SEM)是顯微鏡世家中的一位后起之秀。自第一臺(tái)定型的透射式電子顯微鏡產(chǎn)生后，法國卡諾爾就提出了掃描電子顯微鏡的設(shè)計(jì)思想和工作原理。到1942年劍橋大學(xué)首次制成世界上第一臺(tái)掃描電子顯微鏡。由于掃描電子顯微鏡使用范圍廣，并具備分辨率高、圖像立體感強(qiáng)、放大倍率選擇范圍廣、樣品適應(yīng)性大、制樣方便等優(yōu)點(diǎn)。所以后期發(fā)展速度比透射式電子顯微鏡快的多。70年代已發(fā)展成為性能完善，自動(dòng)化程度高，功能齊全的一種電子光學(xué)儀器。

電子顯微鏡的發(fā)展簡史2023/2/3電鏡室222023/2/3電鏡室232023/2/3電鏡室242023/2/3電鏡室252023/2/3電鏡室262023/2/3電鏡室272023/2/3電鏡室28

電子顯微鏡種類電子顯微鏡種類：由于電子與物質(zhì)相互作用會(huì)產(chǎn)生透射電子、彈性散射電子、能量損失電子、二次電子、背反射電子、吸收電子、X射線、俄歇電子、陰極發(fā)光和電動(dòng)力等等。電鏡就是利用這些信息來對(duì)試樣進(jìn)行形貌觀察、成分分析和結(jié)構(gòu)測定的。主要分為透射式電子顯微鏡(簡稱透射電鏡，transmissionelectronmicroscope，TEM)和掃描電子顯微鏡(簡稱掃描電鏡，scanningelectronmicroscope,SEM)兩大類。2023/2/3電鏡室292023/2/3電鏡室302023/2/3電鏡室31

掃描透射電子顯微鏡(簡稱掃描透射電鏡，STEM)則兼有兩者的性能。為了進(jìn)一步表征儀器的特點(diǎn)，有以加速電壓區(qū)分的，如：超高壓(1MV)和中等電壓(200~500kV)透射電鏡、低電壓(~1kV)掃描電鏡；有以電子槍類型區(qū)分的，如鎢燈絲電鏡、場發(fā)射電鏡；有以用途區(qū)分的，如高分辨電鏡，分析電鏡、能量選擇電鏡、生物電鏡、環(huán)境電鏡、雙束掃描電鏡(FIB)等。有以激發(fā)的信息命名的，如電子探針X射線微區(qū)分析儀(簡稱電子探針)等。

電子顯微鏡種類2023/2/3電鏡室32二、透射電鏡的基本原理

2023/2/3電鏡室33就最基本的原理來說，透射電鏡和光學(xué)顯微鏡是相同的，它們的顯微放大過程基本相似，而且電鏡的光路和部件術(shù)語也同光鏡基本一樣。不同的是，電鏡的照明源不是可見光而是電子束；透鏡也不是玻璃而是軸對(duì)稱的電場或磁場，并且電子顯微鏡的總體結(jié)構(gòu)、成像原理、操作方式等與光學(xué)顯微鏡有著本質(zhì)上的區(qū)別。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室34光源中間像物鏡試樣聚光鏡目鏡毛玻璃電子槍聚光鏡試樣物鏡中間像投影鏡觀察屏照相底板照相底板2023/2/3電鏡室35透射電鏡的基本原理如下：

(一)分辨本領(lǐng)與放大倍數(shù)---分辨本領(lǐng)是指能夠分辨物體上兩點(diǎn)之間的最小距離。光學(xué)顯微鏡的分辨極限為O.2μm，而電鏡的分辨本領(lǐng)可優(yōu)于2

?

，相差達(dá)l000倍，因?yàn)橛绊懝忡R提高分辨本領(lǐng)的主要因素是由于光線的衍射作用。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室36第三章生物醫(yī)學(xué)超微結(jié)構(gòu)分析

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室37光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)由阿貝公式?jīng)Q定

式中d為分辨本領(lǐng)，λ為照明波波長，n為物體與物鏡之間介質(zhì)的折射率，α為物體上的點(diǎn)與物鏡所成夾角的一半。

普通光學(xué)顯微鏡用油浸鏡頭時(shí)n≈1．5，α<90。即sinα<1，用可見光作照明源時(shí)，其平均波長約為5000?，那么，它的分辨本領(lǐng)約為2000?。這說明光學(xué)顯微鏡只能分辨大于2000?的結(jié)構(gòu)。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室38要提高分辨本領(lǐng)，必須采用波長短的照明源。電子顯微鏡的照明源波長約為0.05?，目前最好的電鏡分辨本領(lǐng)已達(dá)1．4?，比光學(xué)顯微鏡提高了1000多倍。---放大倍數(shù)是指物體經(jīng)過儀器放大后的像與物的大小之比。不能增加圖像細(xì)節(jié)的放大倍數(shù)稱為空放大，而與分辨本領(lǐng)相應(yīng)的最高放大倍數(shù)稱為有效放大倍數(shù)，為眼的分辨本領(lǐng)與儀器的分辨本領(lǐng)之比。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室39

透射電鏡的基本原理目前商品電鏡的分辨本領(lǐng)可達(dá)到2?，其有效放大倍數(shù)為

（倍）即100萬倍。這個(gè)倍數(shù)可以從電鏡上直接得到，也可在攝制20萬倍的底片后再以光學(xué)放大5倍來獲得。因此，標(biāo)示電鏡性能的主要指標(biāo)是分辨本領(lǐng)而不是放大倍數(shù)。2023/2/3電鏡室40(二)電子束的產(chǎn)生

電子束是電鏡的照明介質(zhì)。目前大多數(shù)電鏡的電子束是由熱陰極、控制極和陽極構(gòu)成的三極式電子槍產(chǎn)生，其示意圖:

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室41

透射電鏡的基本原理加速極（陽極）電子束燈絲（陰極）控制極（柵極）2023/2/3電鏡室42陰極（燈絲）控制極（柵極）陽極（加速極）電子束聚光鏡試樣2023/2/3電鏡室43

透射電鏡的基本原理陰極又稱為燈絲(包括鎢絲、六鈹化鑭等)，通常用鎢絲制成，通電加熱后燈絲內(nèi)的自由電子熱運(yùn)動(dòng)增加并逸出表面，在加速電壓作用下，陽極相對(duì)陰極形成正電場，逸出陰極的電子在正電場力作用下高速飛向陽極，中心部分的電子因慣性而穿過陽極孔成為照明電子束。2023/2/3電鏡室44控制極靠近陰極表面，相對(duì)陰極加上數(shù)百伏的負(fù)電位，調(diào)節(jié)電位高低可以控制陰極發(fā)射電子的數(shù)目，亦即調(diào)節(jié)了電子束的強(qiáng)弱。鎢陰極在使用時(shí)，由于金屬蒸發(fā)和電子槍內(nèi)殘余氣體的侵蝕，壽命一般為幾十小時(shí)。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室45(三)電子透鏡及其作用運(yùn)行中的電子束只有在通過電場或磁場時(shí)才能改變其運(yùn)動(dòng)軌跡。軸對(duì)稱的電場或磁場可以使電子束聚焦，故稱為電子透鏡，前者叫靜電透鏡，后者叫磁透鏡。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室46

透射電鏡的基本原理BA線圈磁場對(duì)電子射線的作用2023/2/3電鏡室47

磁透鏡使電子會(huì)聚的原理OO’z電子在磁透鏡中的運(yùn)動(dòng)軌跡AC2023/2/3電鏡室48一束電子的螺旋形軌跡是相似的。為便于理解，可設(shè)想將其外周包絡(luò)起來而不考慮其有否旋轉(zhuǎn)，則包絡(luò)線的形狀基本上和光學(xué)玻璃會(huì)聚透鏡的光路相似?，F(xiàn)代的電磁透鏡是在線圈外面套上鐵殼作磁路，并在鐵殼中心置有極靴(polepiece)，使線圈通電后產(chǎn)生的磁場高度集中而又均勻地分布在極靴中心。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室49Oz帶鐵殼的帶極靴的透鏡O’2023/2/3電鏡室50有極靴B（z）沒有極靴無鐵殼z磁感應(yīng)強(qiáng)度分布圖2023/2/3電鏡室51

透射電鏡的基本原理電磁透鏡的焦距決定于磁場強(qiáng)度，磁場強(qiáng)度決定于通過線圈的電流強(qiáng)度。因此，可以調(diào)節(jié)激勵(lì)電流來改變磁場強(qiáng)度，從而達(dá)到改變放大倍數(shù)和進(jìn)行圖像調(diào)焦的目的。由于電磁透鏡像差小，調(diào)節(jié)容易，因此為現(xiàn)代電鏡所普遍采用。但有些電子透鏡不必改變焦距，可采用磁鋼制造形成永久磁場，即為永磁透鏡。2023/2/3電鏡室52

透射電鏡的基本原理電子透鏡的缺陷球差---球差是由于電子透鏡的中心區(qū)域和邊沿區(qū)域?qū)﹄娮拥臅?huì)聚能力不同而造成的。結(jié)果在象平面成了一個(gè)滿散圓斑。象散---磁場不對(duì)稱時(shí)，就出現(xiàn)象差。有的方向電子束的折射比別的方向強(qiáng)，這樣，圓形物點(diǎn)的象就變成了橢圓形的漫散圓斑。色差---電子的能量不同，從而波長不一造成的，電子透鏡的焦距隨著電子能量而改變，因此，能量不同的電子束將沿不同的軌跡運(yùn)動(dòng)。產(chǎn)生的漫散圓斑還原到物平面。2023/2/3電鏡室53(四)反差與成像反差就是像與背景在亮度上的差別。在電鏡中，當(dāng)電子束中的電子碰到樣品中的原子核時(shí)，電子軌道將偏斜一個(gè)角度，這種相互作用的過程稱為彈性散射。彈性散射的強(qiáng)度與樣品元素的原子序數(shù)成正比，原子序數(shù)愈高，對(duì)入射電子的散射能力就愈大。在物鏡的后焦面上裝一接地的光闌，散射角度大的電子被光闌截獲而除去，僅讓透射電子和散射角小的電子穿過光闌孔參與成像，從而形成反差。這個(gè)光闌孔越小(通常為20～30μm)。被截除的散射電子便越多，像的反差也就越好。

透射電鏡的基本原理2023/2/3電鏡室54

透射電鏡的基本原理物鏡光柵在成像中的作用透鏡極靴活動(dòng)光柵成像電子樣品入射電子散射電子2023/2/3電鏡室55

透射電鏡的基本原理生物組織樣品主要由原子序數(shù)很低的碳、氫、氧、氮等元素組成，在電鏡中不能直接

形成反差，因而不能成像。為了獲得生物樣品的反差，必須對(duì)樣品進(jìn)行電子染色，即在樣品制備過程中使組織塊或超薄切片與重金屬鹽類(如鋨、鈾、鉛)相作用，使組織中的某些結(jié)構(gòu)結(jié)合(化合、吸附)重金屬元素，從而增加這些結(jié)構(gòu)對(duì)電子的散射能力以獲得反差，使樣品顯示出清晰的結(jié)構(gòu)來。2023/2/3電鏡室562023/2/3電鏡室57三、透射電鏡的使用

2023/2/3電鏡室58(一)快速檢查合軸的方法

合軸的好壞直接影響著電鏡的性能，所以使用前有必要對(duì)電鏡的合軸進(jìn)行檢查。快速檢查合軸的步驟：

1.將光斑聚到最小，降低燈絲發(fā)射電流，調(diào)出燈絲像，檢查燈絲發(fā)射是否均勻。

2.反復(fù)微量改變第二聚光鏡激勵(lì)電流，觀查光斑是否出現(xiàn)橢圓形，以判斷聚光鏡是否有像散。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室59

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室60

透射電鏡的使用燈絲電流逐步增大時(shí)光斑圖像變化2023/2/3電鏡室61消像散時(shí)光斑圖像變化2023/2/3電鏡室623．調(diào)物鏡激勵(lì)電流從最大到最小(允許使用者觀察電鏡時(shí)調(diào)焦用的最大鈕)，反復(fù)調(diào)整，觀察光斑中心是否偏離熒光屏中心。如有偏離說明照明系統(tǒng)與成像系統(tǒng)合軸不佳。

4．放入樣品聚好焦，找一標(biāo)記移置熒光屏中心，然后向欠焦的方向(減小物鏡激勵(lì)電流的方向)調(diào)中聚焦鈕6～8檔，觀察標(biāo)記是否偏離熒光屏中心，如有偏離說明電流中心合軸不好。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室635．選擇樣品上顆粒密集的地方，在高倍數(shù)下改變物鏡激勵(lì)電流，若圖像出現(xiàn)方向性的結(jié)構(gòu)，說明物鏡有殘存象散。

上述五步的檢查，基本上可以判斷電鏡合軸是否合格。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室64(二)操作鈕(鍵)參量的選擇及使用方法操作鈕(鍵)的參量是使用者根據(jù)樣品、分析、記錄等要求而定。1．加速電壓值的選擇在許多電鏡中，高壓分為20kV、40kV直到100kV，或者更高。所以存在選擇的問題。首先分析加速電壓對(duì)電鏡有關(guān)參量的影響。

(1)加速電壓越高，電子波長越短，分辨率增高。

(2)加速電壓越高，對(duì)于給定的一個(gè)樣品，穿透能力越強(qiáng)，圖像亮度提高。但振幅反差下降。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室65(3)加速電壓在80～100kV時(shí)，透過樣品的電子打在熒光屏上，熒光粉發(fā)光效應(yīng)最佳。

(4)80kv的加速電壓。對(duì)目前多數(shù)照像底片來講，感光效率最好。綜合上述情況，對(duì)于生物樣品來講，加速電壓一般選擇在60～80kV間較為合適。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室662．放大倍數(shù)的選擇

(1)倍數(shù)越高，電子束流照射的樣品范圍越小，樣品信息損失越多。

(2)倍數(shù)越高，樣品上所要求的照明強(qiáng)度越強(qiáng)。倍數(shù)增加兩倍，樣品上的照明強(qiáng)度必須增加4倍。由此會(huì)增大樣品上的輻射損傷。

(3)倍數(shù)增大，樣品及透鏡本身的缺陷隨之增大而突出。

(4)高倍率的圖像較低倍率聚焦、攝影難度大。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室672023/2/3電鏡室682023/2/3電鏡室69

3.倍數(shù)的選擇原則是：放大倍數(shù)與所需要的分辨率相一致。一般在滿足分辨率的條件下，倍數(shù)盡可能選低些。在實(shí)際操作中，為了減少樣品受電子的照射時(shí)間，先在200以下的倍數(shù)內(nèi)粗查樣品全貌，選擇最合適的觀察部位后再提高倍數(shù)。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室704．聚焦：5萬倍以上的圖像聚焦需要有較高的操作技能。聚焦是通過調(diào)整物鏡激勵(lì)電流實(shí)現(xiàn)的。聚焦的方法一般是從粗到細(xì)逐檔調(diào)整。近代高檔次的商品電鏡裝有微控裝置，使用者只須操作一個(gè)鈕(鍵)便可自動(dòng)聚焦。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室71(1)低倍聚焦：一般15000倍以下的圖像為低倍像。低倍像調(diào)正焦點(diǎn)，多使用圖像搖擺器(wobbler·)，目前多數(shù)電鏡裝備此種裝置。它有兩組偏轉(zhuǎn)線圈組成，在偏轉(zhuǎn)線圈上通50周／秒的交流電，使用時(shí)照明束以樣品平面上的一點(diǎn)為中心來回?cái)[動(dòng)。當(dāng)物鏡處于正焦點(diǎn)時(shí)，對(duì)于樣品平面上的一點(diǎn)任意方向發(fā)射的電子到像平面還是一點(diǎn)。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室72當(dāng)物鏡處于過焦或欠焦時(shí)，則在像平面上散焦成兩個(gè)點(diǎn)，圖像呈現(xiàn)擺動(dòng)。通過聚焦使圖像穩(wěn)定，此時(shí)即為正焦點(diǎn)。在15000倍以上的圖像用搖擺器調(diào)焦效果不好。

(2)高倍聚焦：15000倍以上的圖像為高倍像?？刹捎米钚》床罘?，操作方法是：拔出物鏡光闌，調(diào)節(jié)聚焦鈕，圖像出現(xiàn)最小反差時(shí)即為正焦點(diǎn)，然后加入物鏡光闌再進(jìn)行觀察分析。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室73其原理可用干涉理論來解釋，因?yàn)闃悠分腥魏钨|(zhì)量厚度迅速改變的區(qū)域周圍都出現(xiàn)Fresnel環(huán)，此環(huán)在欠焦時(shí)是亮線，過焦時(shí)是黑線，正焦時(shí)完全消失，所以正焦時(shí)像的反差最小。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室745．光闌的選擇(1)聚光鏡光闌孔的選擇：聚光鏡光闌位于聚光鏡下方。是一個(gè)多孔的可動(dòng)光闌。一般三個(gè)孔，典型孔徑為lOOμm、200μm、600μm。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓怅@孔，以改變孔徑角。較薄的樣品為了提高反差(位相反差)需要較小的光闌孔，使照明孔徑角極小。使用較小的聚光鏡光闌孔，可減少薄樣品上的輻射損傷。為兼顧諸方面的因素，實(shí)踐中多采用200μm的光闌孔。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室75(2)物鏡光闌孔的選擇：物鏡可動(dòng)光闌位于物鏡上方，是一個(gè)四孔光闌，典型孔徑為25μm、50μm、75μm、100μm。選擇物鏡光闌孔徑時(shí)，應(yīng)考慮到樣品的厚度。較厚的樣品，散射電子角度大，反差較好，但亮度相對(duì)減小，所以應(yīng)選用較大的孔徑。較薄的樣品為了提高反差選用較小的光闌孔。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室765．樣品的安裝安裝樣品是一件較容易的事，但并非是不重要的事。它的操作關(guān)系到圖像的分辨率，為此安裝樣品時(shí)要求：手不能觸摸進(jìn)入真空系統(tǒng)的部分。以免手上的水分或臟物進(jìn)入電子光學(xué)系統(tǒng)。放樣品時(shí)要擺正放平，使載網(wǎng)與樣品夾持器或樣品杯接觸良好，保證有良好的熱傳導(dǎo)，防止樣品熱漂移。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室776．照像照像是記錄觀察者認(rèn)為感興趣的區(qū)域做為進(jìn)一步分析或長期保存用。目前底片的分辨率高于熒光屏分辨率，所以底片可提供比熒光屏更多的樣品信息。

透射電鏡的使用2023/2/3電鏡室78