從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案

1土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測定設(shè)計(jì)性試驗(yàn)方案一、綜述：的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中,是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑]等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過程中均有重要價(jià)值,如添加淀粉酶分布格外廣泛，是人們常常爭論的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應(yīng)用【1】。二、試驗(yàn)?zāi)康囊罅私馍锓謩e提純的原理和方法技術(shù)把握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法把握微生物搖瓶培育方法及淀粉酶活力測定的原理和方法培育學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物試驗(yàn)方法的力氣培育學(xué)生自行設(shè)計(jì)試驗(yàn)流程、綜合分析問題解決問題和推斷試驗(yàn)結(jié)果的力氣。三、試驗(yàn)原理【2】、分散芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬二、試驗(yàn)?zāi)康囊罅私馍锓謩e提純的原理和方法技術(shù)把握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法把握微生物搖瓶培育方法及淀粉酶活力測定的原理和方法培育學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物試驗(yàn)方法的力氣培育學(xué)生自行設(shè)計(jì)試驗(yàn)流程、綜合分析問題解決問題和推斷試驗(yàn)結(jié)果的力氣。三、試驗(yàn)原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進(jìn)展生長生殖和生命活動(dòng)中所需的各種條件。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說，在土壤外表，由于日光照耀及枯燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm～30cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量削減【5】。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分別生長在平板上的單個(gè)菌落并不愿定保證是純培定，有些微生物的純培育要經(jīng)過一系列分別與純化過程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分別生長在平板上的單個(gè)菌落并不愿定保證是純培定，有些微生物的純培育要經(jīng)過一系列分別與純化過程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗(yàn)陽性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；養(yǎng)分體的最高生長溫25℃到75℃以上；最低生長溫度大約5℃到45℃；生長最低pH值，從7.5—8到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl25%NaCl；養(yǎng)清楚膠〔22℃〕71厘米或1厘米以上。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代個(gè)氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源【6】。細(xì)菌特性生殖快速:106倍。生命力強(qiáng):無濕狀態(tài)可耐低溫-60℃、耐高溫+280℃，耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧生殖)、耐低氧(厭氧生殖)。體積大:體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢，抑制有害菌的生長生殖。四、試驗(yàn)材料和用具4.14.1土樣采集：采集寬闊植物園內(nèi)的有機(jī)土壤，和生化樓下花壇的有機(jī)土壤養(yǎng)分瓊脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉0.5 瓊脂1.5～2.0 蒸餾水15%2mLpH7.2～7.4。參與瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。淀粉牛肉膏蛋白胨培育基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化鈉0.5 瓊脂1.5～2.0 校正pH至7.2～7.4發(fā)酵培育基(%)：玉米粉2 黃豆餅粉1.5 CaCl0.02 MgSO40.02 NaCl0.25K2HPO40.2 檸檬酸鈉0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.0葡萄糖蛋白胨培育V.P試驗(yàn)用〔葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO40.2pH7.2～7.4蛋白胨水培育〔吲哚試驗(yàn)用〔蛋白胨1% 氯化鈉0.5% 校正pH7.～7.4西蒙氏檸檬酸鹽培育基〔%〕：氯化鈉0.5 硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.02 磷酸二氫銨0.1 磷酸氫二鉀0.1 檸檬酸0.5 瓊脂2 溴麝香草酚藍(lán)溶液4 酚紅試劑校正pH6.8先將鹽類溶解于水中，校正pH，再參與瓊脂，加熱溶化，然后參與指示劑，混勻后分裝試管，12115min。配制養(yǎng)清楚膠培育基〔%〕：蛋白胨0.50.31.2，調(diào)pH6.8~7.0耐鹽培育基〔%〕：10.321.5～2.0蒸餾水10.3101.5～2.0蒸餾水10.3201.5～2.0蒸餾水10.3251.5～2.0蒸餾水15%2mL，校正pH7.2～7.4。參與瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀綠溶液,石炭酸復(fù)紅液;香柏油、二甲苯吲哚試驗(yàn)：乙醚、吲哚試劑V.P.試驗(yàn)：40％NaOH溶液、α-奈酚，淀粉酶活力測定：1%3,5-二硝基水楊酸試劑儀器或其它用具無菌玻璃涂棒 無菌吸管 接種環(huán)無菌培育皿 土樣 三角瓶燒杯 洗瓶玻棒試管酒精燈擦鏡紙接種環(huán)酒精燈載玻片吸水紙等。恒溫?fù)u床恒溫培育箱高壓蒸汽滅菌箱超凈工作臺(tái)水浴箱紫外燈照耀箱磁力攪拌器玻1、初篩方法①制菌懸液5g45mL無菌水的三角瓶，振蕩10min,即為10-1124組，編AB。②加熱篩選有芽孢的菌：將2個(gè)錐形瓶加塞、包扎、搖勻〔無菌室里〕，利用恒溫水浴裝置100℃左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持15min〔制懸液時(shí)就應(yīng)先開頭加熱〕，制成10-1g/ml的土壤懸液③梯度稀釋菌懸液：9mL5支，用記號(hào)筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌的移液器吸取1mL土壤懸液參與10-210-2土壤10-21mL10-3的無菌水試管中，混勻后即10-310-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用一樣的移液槍頭由濃到稀來稀釋。④涂布平板用一支的無菌槍頭，由低濃度開頭，從各濃度土壤稀釋液中各100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培育基平板3個(gè)平板〔重復(fù)〕。3724h。2、復(fù)篩方法【1】劃線接種〔分區(qū)劃線法〕：在上述不同稀釋度培育基中挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)展分區(qū)劃線先在平板培育基的一邊作第1次平行劃線3~4條，60122次平行劃線局部作第334〔如右圖。劃28~29°C20h.。再連續(xù)分區(qū)2-3次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩局部，其中一局部接種到培育基內(nèi)，用以保存菌種，另一局部用來做染色試驗(yàn)。3、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不全都的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培育基8537℃24h。上述點(diǎn)接后的平板中取出一組四個(gè)分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培育基平板于試驗(yàn)室，其他置37℃下培育24h斜面接種。34革蘭氏染色步驟：涂片、枯燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其掩蓋涂面1分鐘，后水洗。95%酒精進(jìn)展脫色約15－20秒，后馬上用流水沖洗。3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀看染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢：·3718～24h的枯草芽孢桿菌涂片，枯燥，固定?！?～55%孔雀綠水溶液?！?～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料?！A去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。·用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗?！ぶ破菰锖笥糜顽R觀看。芽孢呈綠色，菌體紅色?！沧ⅲ河^看芽孢的外形和位置，查伯杰細(xì)菌手冊(cè)〕斜面保存菌種·貼標(biāo)簽取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼上，貼在試管2～3cm〔3管，標(biāo)上一樣編號(hào)也要與平板上菌落編號(hào)相對(duì)應(yīng)〕。進(jìn)展斜面接種操作，加塞、包扎好到37℃培育箱里培育24h。5、菌種的鑒定所得的斜面菌種接種到的平板上培育以觀看篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕狀況、形態(tài)、高度、透亮程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進(jìn)展一系〔具體步驟同上觀看是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)生理生化試驗(yàn)溫度對(duì)菌種培育的影響；淀粉水解試驗(yàn)；溫度對(duì)菌種的影響；明膠液化試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V.P試驗(yàn))；吲哚試驗(yàn)；耐鹽性試驗(yàn)；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)?！囟葘?duì)微生物生長的影響將牛肉膏蛋白胨培育基熔化倒平板?！才嘤穸葹橐话闩嘤?.52倍〕30套牛肉膏蛋白胨平板，分別進(jìn)展標(biāo)號(hào)。在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個(gè)菌種重復(fù)接種六個(gè)平板。各取每個(gè)菌種兩套平板倒置于4℃〔冰箱〕、37℃〔或者室溫〕，60℃下24小時(shí)，觀看細(xì)菌的生長狀況?！病啊辈簧L，“+”生長較差，“++”生長一般，“+++”生長良好。·淀粉水解試驗(yàn)以18-24h的純培育物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板〔“字接種，〕或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1℃培育24-48h，或于20℃培育5天。然后將碘性反響〔淀粉被分解〕為瓊脂培育基呈深藍(lán)色、菌落或培育物四周消滅無色透亮環(huán)、或肉湯結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的力氣、培育時(shí)間，培育基含有淀粉量和pH等均有確定關(guān)系。培育基pHpH7.2為妥?！ぬ穷惏l(fā)酵試驗(yàn)〔葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵〕用小砂輪輕輕切割發(fā)酵管沒有標(biāo)簽和標(biāo)識(shí)的另外一端，留意保存標(biāo)簽和糖的名稱。用接相對(duì)應(yīng)。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白比照。留意接種的整個(gè)過程中，不能人為的作廢應(yīng)重做一管。接種后，每一管外包一層無菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發(fā)酵管倒置于干凈小燒杯內(nèi)，3724h。觀看記錄：與比照管比較，假設(shè)接種培育液保持原有顏色，其反響結(jié)果為陰性，說明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培育液呈黃色，反響結(jié)果為陽性，說明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“＋”表示。培育液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反響，說明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反響，記錄用“－”?！ひ阴＜谆状荚囼?yàn)(V．P試驗(yàn))標(biāo)記試管：取裝有葡萄糖蛋白胨培育液的試管，編號(hào)。接種培育37℃恒溫箱中，24h。觀看記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別參與40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37℃恒溫箱中保溫15～30min后，假設(shè)培育液呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陽性反響〔用“＋”表示〕；假設(shè)不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反響〔用“－”表示〕?！み胚嵩囼?yàn)試管標(biāo)記取裝有蛋白胨水培育液的試管，編號(hào)。接種培育以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，空白比照管不接種，置37℃恒溫箱中24h。觀看記錄在培育液中參與乙醚1～2ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培育液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢參與5～10滴吲哚試劑〔防破壞乙醚層影響結(jié)果觀看〕性反響，否則為陰性反響，陽性用“＋”、陰性用“－”表示?！つ望}性試驗(yàn)將分別獲得的細(xì)菌分別接種在NaCl濃度為2%，10%，20%，25%，的牛肉膏蛋白胨液體培育基中,37℃下培育,[7]?！幟仕猁}試驗(yàn)取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培育基的試管分別標(biāo)記待測菌種的編號(hào)和空白比照以無菌操作分別將少量菌苔接種于各支相應(yīng)的管中，然后置于37℃恒溫箱中培育24h。觀看結(jié)果，假設(shè)培育基變藍(lán)色，則說明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長，即為陽性反響，以“＋”表示。假設(shè)培育基仍為綠色則為陰性反響，以“－”表示【8】。6、產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的測定發(fā)酵：將初篩純菌種接種于30/250mL種子培育基,37℃、250r/min搖床培育過夜。離心10min,取上清液測酶活,每個(gè)樣品重復(fù)3次,最終結(jié)果取平均值。熱10min，然后加適當(dāng)稀釋的酶液0.5ml，反響5min后，用5ml0.1mol/LH2SO4終止反響。取0.5ml反響液與5ml碘液顯色，在620nm處測光密度。以0.5ml水代替0.5ml反響液為空白，以不加酶液〔加同樣體積的緩沖液〕的管為比照。酶活力依據(jù)下式計(jì)算：酶活力〔u/ml〕=(R-r)/R*50*D式中R、r分別表示比照和反響液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使〔R-r〕/R在0.2-0.7之間。確定在40℃5min內(nèi)水解1mg淀粉的酶量為一個(gè)活力單位。菌種保藏法〔斜面冰箱包保藏法〕將菌種接種在穎外面培育基上，定溫培育長出飽滿菌苔后〔一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢〕，貼上標(biāo)簽，放在試管上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，以防