GB/T 27539-2011動(dòng)物流感檢測(cè)A型流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法

ICS11220

B41.

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T27539—2011

動(dòng)物流感檢測(cè)A型流感病毒

通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法

Animalinfluenzadetection—Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionof

influenzavirusA

2011-11-21發(fā)布2012-03-01實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

GB/T27539—2011

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出

。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口

(SAC/TC181)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局中華人民共和國(guó)廣東出入境檢驗(yàn)檢疫

:、

局深圳匹基生物工程有限公司

、。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人汪琳林志雄周琦高志強(qiáng)陳茹喬彩霞蒲靜楊偉梁成珠

:、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T27539—2011

動(dòng)物流感檢測(cè)A型流感病毒

通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了型流感病毒通用熒光檢測(cè)的操作方法

ART-PCR。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于活動(dòng)物及其產(chǎn)品中型流感病毒的檢測(cè)

A。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文

。,

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件

。,()。

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T6682

實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB19489

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

GB/T19495.2

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫

GB/T27401

進(jìn)出口生熟毛皮檢驗(yàn)規(guī)程

SN/T1330、

3縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件

。

值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

Ct:(Ctvalue)

焦碳酸二乙酯

DEPC:(diethylpyrocarbonate)

磷酸鹽緩沖液配方見(jiàn)附錄

PBS:(A)(phosphatebuffersaline)

核糖核酸

RNA:(ribonucleicacid)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

RT-PCR:-(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)

4原理

流感病毒屬正粘病毒科根據(jù)抗原特性及其基因特性的不同流感病毒分為甲

(influenzavirus),,

乙丙型乙型變異性較弱丙型抗原性比較穩(wěn)定僅感染人類(lèi)甲型抗原變異性最強(qiáng)

(A)、(B)、(C)。、,;(A),

感染人類(lèi)和其他動(dòng)物常引起世界性大流行編碼基質(zhì)蛋白的基因是型流感病毒共有且較保守

,。MA。

采用技術(shù)針對(duì)基因中特定序列合成一對(duì)特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針探

Taqman,M,,

針的端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)在退火階段一對(duì)引物和一條探針

5′(R),3′(Q)。PCR,

同時(shí)與目的基因片段結(jié)合探針上基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被基團(tuán)所吸收儀器檢測(cè)不到所發(fā)出的

,RQ,R

熒光信號(hào)在延伸階段酶在引物的引導(dǎo)下沿著模板鏈合成新鏈當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合

;PCR,Taq,

部位時(shí)受到探針的阻礙而無(wú)法繼續(xù)酶發(fā)揮外切核酸酶的功能將探針?biāo)獬蓡魏塑账針?biāo)

,,Taq5′→3′,,

記在探針上的基團(tuán)就游離出來(lái)所發(fā)出的熒光不為所吸收而被檢測(cè)儀所接收隨著反應(yīng)的