生物芯片的制作

生物芯片的制作409本節(jié)要點(diǎn)生物芯片制作方法生物芯片制作的主要步驟芯片片基的制作點(diǎn)樣樣品芯片雜交生物芯片的制作方法一般有三種方法1.原位合成法：指根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的點(diǎn)陣序列在每個(gè)位點(diǎn)通過(guò)有機(jī)合成的方式直接聚合得到所要求的探針?lè)肿?。聚合之后芯片片基的制作即告結(jié)束。該方法有兩類(lèi)：原位光刻合成與壓電打印法。2.點(diǎn)樣法：直接將核酸片段“點(diǎn)”至被包被過(guò)的芯片表面做靶片段。3.分子印章原位合成法：該方法根據(jù)陣列合成的要求設(shè)計(jì)并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的順序，將寡核苷酸合成試劑涂布在不同的印章上，逐個(gè)依次壓印到芯片特定位點(diǎn)進(jìn)行合成反應(yīng)。原位光刻合成原位光刻合成的簡(jiǎn)要過(guò)程：首先使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基將其保護(hù)起來(lái)。每次選擇適當(dāng)?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。這樣，光通過(guò)蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基脫保護(hù)而活化。因?yàn)楹铣伤玫膯误w分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護(hù)基的保護(hù)，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位在反應(yīng)后仍舊帶有光敏保護(hù)基團(tuán)。因此，每次通過(guò)控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類(lèi)和反應(yīng)次序，就可以實(shí)現(xiàn)與待定定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。優(yōu)點(diǎn)：合成效率高，點(diǎn)陣密度高缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)率低。

原位光刻合成

原位光刻合成基本原理圖壓電打印法壓電打印法的簡(jiǎn)要過(guò)程：其裝置與普通的的彩色噴墨打印機(jī)相似，所以技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。即，將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑替代，支持物經(jīng)過(guò)包被后，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制噴墨打印機(jī)將特定種類(lèi)的試劑噴灑到特定的區(qū)域上。沖洗、去保護(hù)、偶聯(lián)等則同于一般的固相合成技術(shù)?？梢院铣砷L(zhǎng)度為40-50個(gè)堿基的探針。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備廉價(jià)，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)產(chǎn)率高缺點(diǎn)：點(diǎn)陣密度低，易產(chǎn)生交叉污染。

壓電打印法

點(diǎn)樣法點(diǎn)樣法的簡(jiǎn)要過(guò)程：是將預(yù)先通過(guò)液相化學(xué)合成好的探針、PCR擴(kuò)增技術(shù)cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過(guò)由陣列復(fù)制器或陣列點(diǎn)樣機(jī)及電腦控制的機(jī)器人準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片相應(yīng)的位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到芯片。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備廉價(jià)、技術(shù)簡(jiǎn)便、研制周期短、靈活性高缺點(diǎn)：點(diǎn)陣密度低點(diǎn)樣法點(diǎn)樣法的方式1.接觸式點(diǎn)樣點(diǎn)樣針直接與固定支持物表面接觸，將DNA樣品留在固定支持物。2.非接觸式點(diǎn)樣（噴點(diǎn)）它是以壓電原理將DNA樣品通過(guò)毛細(xì)血管直接噴至固相支持物表面點(diǎn)樣法主要步驟1.芯片制備目前制備芯片主要是以玻片或硅片為載體，采用原位合成和點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序加載到載體上。制備材料：準(zhǔn)備固定在芯片的生物分子樣品、芯片片基、制作新片的儀器2.樣品制備將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用的安全性。3.雜交反應(yīng)4.信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析芯片片基的制作芯片片基即載體材料目前常用的芯片片基都選擇經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等作為支持物。做原位合成的支持物在聚合物發(fā)應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定），并與保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)樣用的支持物，為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針?lè)肿?，通常需包被以氨基硅烷或多聚?lài)氨酸

芯片片基的制作

兩種常見(jiàn)的載體1.膜優(yōu)點(diǎn)：與核酸親和力強(qiáng)，雜交技術(shù)成熟，通常無(wú)需被寶貝2.玻片優(yōu)點(diǎn)DNA樣品以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在處理過(guò)的玻片上；玻璃是種耐用的材料；能提高探針與目的分子的退火效率不會(huì)有背景影響。由玻片為載體的芯片更具有的發(fā)展和應(yīng)用的前景點(diǎn)樣樣品點(diǎn)樣樣品點(diǎn)樣樣品的制備是非常關(guān)鍵的一步。樣品的純度、雜交特異性直接決定自制芯片的質(zhì)量和可信度對(duì)于大規(guī)模制作芯片的用戶(hù)，由于點(diǎn)樣樣品數(shù)目太多，即采用高通量試劑盒還是不夠方便，可以采用全自動(dòng)核酸和蛋白質(zhì)純化工作站。芯片雜交DNA雜交：當(dāng)兩個(gè)來(lái)源不同的單鏈DNA分子（DNA片段）核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，在復(fù)性條件下，可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)成為雙鏈“雜種”DNA分子（DNA片段）的過(guò)程。DNA雜交探針：指帶有某種標(biāo)記物的特異性核苷酸序列，能與該核苷酸序列互補(bǔ)的DNA進(jìn)行退火雜交，并可以根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)進(jìn)行有效的檢測(cè)。（早期用的是32p）雜交的方法有southern印跡雜交、斑點(diǎn)印跡雜交和菌落(或噬菌斑)原位雜交等。芯片雜交方法southern印跡雜交：先從轉(zhuǎn)化子中提取總DNA，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分帶，轉(zhuǎn)移到用于雜交的膜上，變性處理在用DNA探針與其雜交。斑點(diǎn)印跡雜交：把提取的轉(zhuǎn)化子總DNA直接點(diǎn)樣到用于雜交的膜上，變性處理后再用DNA探針與其雜交。菌落原位雜交：直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移至用于雜交的膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合，在用DNA探針與其雜交

芯片雜交方法

southern印記雜交法兩種典型的生物芯片片上就位合成寡核苷酸點(diǎn)陣芯片（ONA）和用微量點(diǎn)樣技術(shù)制作的cDNA點(diǎn)陣芯片（CDA）操作流程見(jiàn)p298當(dāng)雜交混合物中靶標(biāo)濃度約10倍與互補(bǔ)分子時(shí)，出現(xiàn)假一級(jí)發(fā)應(yīng)動(dòng)力學(xué)。此時(shí)雜交速率主要取決于探針濃度。當(dāng)靶標(biāo)濃度等于或低于探針濃度時(shí)，出現(xiàn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。此時(shí)固定DNA濃度的微小差異，將對(duì)雜交信號(hào)和速率產(chǎn)生極大影響。

兩種典型的生物芯片

CDA芯片的合成與雜交

兩種典型的生