第5章高效液相色譜法

4-1高效液相色譜概述

您有一個問題需要解決我急需一個測定我們某些產(chǎn)品中糖類化合物的定分離方法.我需要一種分離技術(shù)。我來解決這個問題!分離技術(shù)我們實驗室有兩種分離技術(shù),高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）.我應(yīng)該使用哪種呢?HPLC和GC的比較壓樣品揮發(fā)性樣品極性HPLC

沒有揮發(fā)性要求

樣品必須溶于流動相GC

樣品必須是可揮發(fā)的HPLCGC

可分離極性和非極性化合物

從多環(huán)芳烴（PAH）到無機離子

樣品是非極性和極性的HPLC和GC的比較HPLC和GC的比較樣品的熱穩(wěn)定性樣品的分子量HPLC

分析可以在室溫或低于室溫的條件下進(jìn)行

GC

樣品必須能經(jīng)受進(jìn)樣口

和色譜柱的高溫HPLCGC

沒有理論上限

在實際上,溶解性能是一個限制.

典型的分子量<500amuHPLC和GC的比較樣品制備樣品量HPLC

樣品必須經(jīng)過濾

樣品溶劑應(yīng)當(dāng)與

流動相相同GC

溶劑必須是可揮發(fā)的

且其沸點一般要低于

被分析物的沸點

HPLCGC

樣品量取決于

色譜柱內(nèi)徑.

典型的進(jìn)樣量1-5L

HPLC和GC的比較分離機理檢測器HPLC

固定相和流動相都參與分離GC

流動相只是樣品的載體HPLCGC

常用UV-Vis

應(yīng)用范圍寬的非破壞性

檢測器3維檢測器

靈敏度為pg級

最常用FID,

有機化合物通用糖類化合物1.果糖2.葡萄糖3.蔗糖4.Palatinose5.海藻糖6.異麥芽糖色譜柱：ZorbaxNH2(4.6x250mm)流動相：70/30乙腈/水流速：1mL/min檢測：折光指數(shù)檢測器12345mAU保留時間6我們?nèi)绾畏治鲞@一樣品?分離進(jìn)樣器r檢測器r色譜柱溶劑混合器泵基于固定相和流動相之間差速遷移進(jìn)行分離.固定相-固定在色譜柱中的相，如，C18,硅膠流動相-隨著流過色譜柱，將樣品載送通過固定相.高效液相色譜儀廢液分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑混合器泵色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間高效液相色譜儀分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑混合器泵色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離I進(jìn)樣器檢測器r色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器r色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離I進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間分離進(jìn)樣器檢測器r色譜柱溶劑泵混合器色譜圖開始進(jìn)樣mAU保留時間HPLC分析參數(shù)泵脫氣裝置自動進(jìn)樣器柱箱溶劑儲液瓶檢測器流動相流速組成進(jìn)樣體積色譜柱柱箱溫度波長時間常數(shù)HPLC的分離模式化合物類型模式固定相流動相中性弱酸弱減反相C18,C8,C4氰基,氨基水/有機改性劑離子型,堿,酸離子對C-18,C-8水/有機離子對試劑在水中不溶的化合物正相硅膠,氨基,氰基,二醇基有機相離子，無機離子離子交換陰離子或陽離子交換樹脂水相/緩沖液對離子高分子量化合物聚合物體積排阻聚苯乙烯硅膠對于凝膠過濾色譜-水相對于凝膠滲透色譜-有機相HPLC應(yīng)用化學(xué)工業(yè)環(huán)境保護(hù)制藥行業(yè)消費產(chǎn)品臨床診斷聚苯乙烯染料鄰苯二甲酸酯四環(huán)素皮質(zhì)甾類抗抑郁劑巴比妥鹽氨基酸維生素高半胱氨酸生命科學(xué)蛋白質(zhì)多肽核酸類脂類抗氧化劑糖多環(huán)芳烴屋無機離子除草劑4.2高效液相色譜儀流程及主要部件流程2.主要部件高壓輸液系統(tǒng)：一般由貯液器、高壓泵、脫氣、梯度洗脫裝置高壓泵為主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性單元泵雙元泵

高壓泵作用：輸送流動相。也即是貯液瓶中的有機溶劑或緩沖溶液靠高壓泵送入色譜柱。由于色譜柱的阻力很大，高壓泵必須克服阻力以恒定流速輸送流動相，這是保證色譜儀精確度的前提。

常用的壓力范圍：150～350×105Pa歐美等國家習(xí)慣使用psi作單位

PSI英文全稱為Poundspersquareinch。定義為英鎊/平方英寸，它們之間的換算關(guān)系為：1bar≈14.5psi=105Pa，

145psi=1Mpa

1psi=6.895kPa=0.06895bar高壓泵應(yīng)具有以下性能流量穩(wěn)定，精度在1%左右輸出壓力高，通常20~30MPa，最高50MPa流量范圍寬，一般在0.01~10mL/min范圍內(nèi)能抗溶劑腐蝕壓力波動小、更換溶劑方便、容易清洗、具梯度洗脫操作方便、容易維修

根據(jù)泵的操作原理不同，分為恒壓泵和恒流泵

氣動放大泵（恒壓泵）

往復(fù)泵（恒流泵）是目前液相色譜使用最普遍的一種高壓泵。其中又分單頭往復(fù)泵和雙頭往復(fù)泵。往復(fù)泵的優(yōu)點是泵頭內(nèi)腔體積小，容易洗凈，故更換溶劑十分方便，尤其適合做色譜條件試驗時使用。

氣動放大泵往復(fù)柱塞泵洗脫方式(一)恒組成溶劑洗脫:

優(yōu)點是方法簡便、柱易再生，但對于成分復(fù)雜的混合物，往往不能滿足性質(zhì)相差較大的組分的分離．此時需用梯度洗脫。適用對象：組分較多、性質(zhì)差別較大的復(fù)雜混合物優(yōu)點：①縮短分析周期；②提高分離效能；改善峰形，減少拖尾；④使峰變銳，能檢測出微量組分，因而提高檢測靈敏度：缺點：易引起基線漂移，重現(xiàn)性差（二）梯度洗脫：在同一分析周期內(nèi)．按—定程度不斷改變流動相的濃度配比，從而使每個組分都在適宜的條件下獲得分離的一種洗脫方法。梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。一般流出問題早流出峰的分離度差.遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k’范圍寬，所以分析時間長.強保留組分造成柱污染.等梯度洗脫-在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變.AnalyticalEducationCenterH5929A11-09梯度洗脫-一個解決方案優(yōu)點

改善分離度

提高檢測性能

能夠分離復(fù)雜樣品

縮短分析時間

降低由于強保留組分而使色譜柱性能變差的可能性其他應(yīng)用

柱清洗

方法開發(fā)中的嘗試運行

梯度洗脫-在分離過程中改變流動相組成.色譜柱: ZORBAX300SB-C3 5μm,4.6x150mm梯度t: 15-35%Bin19min.流動相: A:95:5H2O:ACN 含0.1%TFA B:5:95H2O:ACN 含0.085%TFA1.亮氨酸腦菲肽2.血管緊張肽3.核糖核酸酶A4.胰島素5.細(xì)胞色素C6.溶菌酶7.肌紅蛋白8.碳酸酐酶多肽的梯度分離梯度的特點

兩種溶劑用來形成梯度

洗脫強度隨時間增加

考慮梯度曲線形狀

考慮梯度的陡度梯度方法開發(fā)-優(yōu)化溶劑梯度5%有機相100%有機相從嘗試運行開始-一個平緩的梯度您必須確定:

有機溶劑

初始組成

梯度時間

梯度陡度

梯度形狀

流速

柱長

柱重新平衡時間AnalyticalEducationCenter線性梯度對下列每種情況，您認(rèn)為使用哪種梯度曲線能改善分離?線性梯度線性梯度改變流速5%/min1ml/min->5%/ml5%/min2.5ml/min->2%/ml(2)進(jìn)樣裝置

手動進(jìn)樣閥通常使用耐高壓的六通閥(美國Rheodyne公司專利技術(shù))，其結(jié)構(gòu)如圖所示：

進(jìn)樣裝置（正面）

進(jìn)樣裝置（背面）手動進(jìn)樣器前視圖后視圖樣品定量管圖中a為進(jìn)樣閥處于“裝樣load”位置的情況，此時流動相直接進(jìn)入色譜柱，樣品注入口與樣品環(huán)連接，用微量進(jìn)樣針將一定體積的樣品溶液從樣品注入口注入，裝于樣品管內(nèi)。當(dāng)將扳手扳至“進(jìn)樣inject”位時，進(jìn)樣閥的流路發(fā)生了改變，流動相通過樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進(jìn)行分析。六通進(jìn)樣閥具有使用方便，進(jìn)樣量準(zhǔn)確等優(yōu)點。

樣品環(huán)(Loop)規(guī)格：有10μL、20μL、50μL等不同容積，可以根據(jù)需要選配。作用：用來貯液，也用來測量樣品溶液的體積。將樣品環(huán)裝滿后進(jìn)樣，進(jìn)樣量即為樣品環(huán)的容積，此種進(jìn)樣方式稱為“滿環(huán)進(jìn)樣”或“定量環(huán)進(jìn)樣”。用定量環(huán)進(jìn)樣精密度好，在使用外標(biāo)法時，應(yīng)使用此種操作方式。

自動進(jìn)樣器

色譜柱是高效液相色譜的心臟，在HPLC的使用中，保持色譜柱的柱效，延長柱子的使用壽命非常重要。

（3）色譜柱色譜柱流速方向色譜柱的參數(shù)色譜柱（Column）結(jié)構(gòu)：柱管多用不銹鋼制成，色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，目的是防止填料漏出。填料：多以硅膠為基質(zhì)，適用PH2～8粒度多為0.2～20μm(以5～10μm居多)。

發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

規(guī)格：常規(guī)分析柱(常量柱)內(nèi)徑2～5mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱長10～30cm(15cm，25cm居多）制備柱（內(nèi)徑21.2mm、30mm、50mm）半制備柱（〉5mm，7.8mm、9.8mm、10mm）C18柱（C8柱）主要是由于修飾到硅膠上的硅烷化試劑不同。C8是修飾的帶8個碳原子的硅烷，C18是修飾的帶18個碳原子的硅烷。C18較C8極性小，C18更適合分析中等到小極性的化合物，C8更適合中等偏大極性化合物。C18柱（C8柱）性能影響因素物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)正相柱：固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團，如胺基(NH2)和氰基(CN)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱；正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷、氯仿、二氯甲烷等。

反相柱：固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇，乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。正相柱和反相柱

預(yù)柱和保護(hù)柱從泵來的流動相預(yù)柱進(jìn)樣口保護(hù)柱分析柱檢測器預(yù)柱是針對流動相來保護(hù)色譜柱保護(hù)柱是針對樣品來保護(hù)色譜柱precolumn——預(yù)柱，guardcolumn——保護(hù)柱

安裝位置不同：預(yù)柱是泵后進(jìn)樣口前，途經(jīng)流動相；保護(hù)柱是進(jìn)樣口后分析柱前，途經(jīng)樣品和流動相。

作用不同：預(yù)柱則只能起到過濾顆粒物作用，防止顆粒物堵塞色譜柱篩板引起柱壓升高。保護(hù)柱除了可以過濾顆粒物外，因為帶1厘米長的填料，強保留物質(zhì)就先留在保護(hù)柱的柱芯填料里面，這樣可以避免色譜柱被強保留物質(zhì)污染。色譜柱的故障與異常柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長

柱壓過高為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機械震動造成柱床產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干涸

柱效低

重復(fù)性差，回收率低實驗的重復(fù)性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強或流動相過弱非特異性吸附

(4)液相色譜檢測器分類

按檢測原理：光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）熱學(xué)檢測器(如吸附熱）電化學(xué)學(xué)檢測器（如庫倫、安培）電學(xué)檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)）按測量性質(zhì)：通用型檢測器（如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器）專屬型檢測器（如紫外、熒光檢測器）按檢測方式：濃度型檢測器質(zhì)量型檢測器著重介紹四種檢測器：紫外檢測器（光電二極管陣列檢測器）、示差折光檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器(質(zhì)譜也是一種HPLC的檢測器，單獨在液質(zhì)聯(lián)用部分介紹）工作原理：基于朗伯-比爾定律。即用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長可變和光電二極管陣列三種類型。紫外檢測器(ultravioletdetector,UVD)：應(yīng)用最廣泛的選擇性檢測器。

雙波長紫外檢測器2487（190-700nm)特點：選擇性檢測器，靈敏度較高（10-9g），噪音低。線性范圍寬，對流速和溫度波動不靈敏，適用于梯度洗脫。Waters996光電二極管檢測器（PDA）(190-800nm連續(xù)掃描)缺點：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)。而且對流動相也有一定的限制，即流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。溶劑UV截止波長（nm）乙腈190水190環(huán)己烷195己烷200甲醇210乙醇210乙醚220二氯甲烷220氯仿240四氯化碳265四氫呋喃280（220）甲苯285在使用紫外檢測器時，檢測波長與所用溶劑的截止波長接近（或低于截止波長）時，容易產(chǎn)生噪音干擾，從而影響檢測結(jié)果。所以在使用紫外檢測器時，檢測波長應(yīng)至少比所用溶劑的截止波長大20nm以上。截止波長

二極管陣列檢測器（diode-arraydetector,DAD）：以光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的UV-VIS檢測器（圖2）。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測器不同的是，普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進(jìn)入流動池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測。

1.直接紫外檢測：所使用的流動相為在檢測波長下無紫外吸收的溶劑，檢測器直接測定被測組分的紫外吸收強度。多數(shù)情況下采用直接紫外檢測。

2.間接紫外檢測：使用具有紫外吸收的溶液作流動相，間接檢測無紫外吸收的組分。在離子色譜中使用較多，如以具有紫外吸收的鄰苯二甲酸氫鉀溶液作陰離子分離的流動相，當(dāng)無紫外吸收的無機陰離子被洗脫到流動相中時，會使流動相的紫外吸收減小。

3.柱后衍生化光度檢測：對于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色配合物的組分（過渡金屬離子、氨基酸等），可以在組分從色譜柱中洗脫出來之后與合適的顯色劑反應(yīng)，在可見光區(qū)檢測生成的有色配合物。

原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度的檢測器。特點：通用性檢測器；對溫度變化比較敏感，要保持在±0.001℃（需配柱溫箱使用）；靈敏度低(10-6g)；不能用于梯度洗脫。b.示差折光檢測器

(differentialrefractiondector)Waters410示差折光

原理:利用某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光(熒光)的性質(zhì)進(jìn)行檢測。許多藥物和生命活性物質(zhì)(多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等)具有天然熒光，能直接檢測。

c.熒光檢測器

(fluorescencedetector,FD)Waters474熒光

原理：許多有機化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機胺、維生素、激素、酶等，被一定強度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。熒光強度與激發(fā)光強度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測。

結(jié)構(gòu)：如圖

特點:選擇性檢測器，靈敏度比紫外檢測器高2-3個數(shù)量級，可達(dá)到10-12g；選擇性好，對流量和溫度敏感性低。缺點：只適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的檢測。

通過熒光衍生化可以使本來沒有熒光的化合物轉(zhuǎn)變成熒光衍生物，從而擴大了熒光檢測器的應(yīng)用范圍。工作原理:通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣(氮氣)噴成霧狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。在檢測器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。d.蒸發(fā)光散射檢測器(evaporativelight-scattingdetector,ELSD)Waters2420蒸發(fā)光散射適用范圍：適用檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類，高級脂肪酸，磷脂，維生素，氨基酸，甘油三酯及甾體等。特

點：通用型檢測器，對各物質(zhì)有幾乎相同的響應(yīng)。消除溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度比較低（尤其對有紫外吸收的組分）流動相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽等。5.3HPLC分離模式

1.正相LC(NP-LC）

2.反相LC(RP-LC)

3.反相離子對LC(IP-LC)

4.離子交換LC(IEC)

5.體積排阻色譜(SEC)

NP-LC

在這一部分您將學(xué)習(xí):正相HPLC分離機理和應(yīng)用.

正相HPLC洗脫順序.

如何選擇正相色譜柱.

如何選擇正相色譜流動相.OSiOSiOSiOOHHOROHHORO吸附色譜-正相機理氫鍵作用

偶極-偶極作用-絡(luò)合鍵合

溶質(zhì)取代溶劑

固定相

硅膠

氰基鍵合相

氨基鍵合相

二醇鍵合相

流動相有機溶劑正相HPLC固定相比流動相的極性強正相HPLC適合于分離:

異構(gòu)體混合物

在有機溶劑/水流動相中不容易溶解是化合物

弱極性到中等極性的化合物.保留順序保留作用增大極性COHO酸OCNH2酰胺OHNH2醇、胺COCHO酮、醛、酯CORONO2硝基ROR醚F,Cl鹵素芳烴CH3烴極性最大的官能團決定保留的強弱.分離選擇性O(shè)CH3官能團NO2異構(gòu)體k'k'C=NC-HBrBrBrBr0.61.82.75.53.86.9o異構(gòu)體的正相色譜分離OFCH2OCH2CH3CH3CH=CCl2高效氟氯氰菊酯

4個異構(gòu)體反相色譜異構(gòu)體未分離正相色譜4個異構(gòu)體均被分離1.保棉磷2.三唑酮3.高效氟氯氰菊酯4.DEF固定相SiOSiCH3CH3CH2CHOHCH2OHSiOSiCH3CH3(CH2)nCN正相色譜方法開發(fā)的首選固定相.極性最強SiOH最適合于異構(gòu)體分離SiOSiCH3CH3(CH2)nNH2

可替換的選擇性鍵合相的優(yōu)點

不必控制水

可以梯度洗脫

色譜柱平衡快

極性和選擇性范圍寬

柱容量大

色譜峰不像在裸硅膠柱上那樣拖尾洗脫強度氟代烷烴正戊烷正己烷1-氯丁烷苯二甲苯氯仿甲苯二氯甲烷乙酸乙酯四氫呋喃乙腈甲醇-0.200.000.010.200.200.240.260.280.320.380.440.500.70溶劑洗脫強度硅膠非定位堿性定位非堿性定位二氯甲烷氯仿氯代丙烷弱溶劑己烷,氟代烷

甲基特丁基醚四氫呋喃乙醚乙酸乙酯乙腈正戊烷二氯甲烷X=二甲苯T=甲苯B=苯X+T+BCH3H3CCH3=0.0=0.32分離原理60208040.10.20.30.40.50.60AB100%B等洗脫強度要改變選擇性,常用等洗脫強度的不同溶劑組合.(C2H5)2NH/C5H12乙酸甲酯/C5H12CH2Cl2/C5H12A=戊烷對各類化合物的溶劑強度芳烴鹵化物硫醇醚硝基化合物,酯,亞硝酸鹽,羰基化合物醇酚胺酸酰胺0.05-0.250.0-0.30.00.10.2-0.30.30.30.2-0.60.40.4-0.6-0.2-0.25-0.2-0.1-0.20.00.10.20.20.0-0.40.30.3-0.5化合物類型無水溶劑50%H2O飽和溶劑減活化劑-用于硅膠柱用中等強度的溶劑沖洗色譜柱，以避免長的平衡時間.裸硅膠柱可能有如問題:

保留時間波動

峰拖尾

平衡時間長原因:

硅膠上的強極性吸附位點解決辦法:

流動相中加入少量極性溶劑，

如水或乙腈

制造更均一的表面方法50%水飽和方法

混合流動相

等分為兩份

將無水溶劑保存在分子篩上

制備一個水飽和組分

按1:1混合無水溶劑和水飽和溶劑

將0.1-1%的水與水溶性溶劑混合

在戊烷、己烷、庚烷中加入0.05%的乙腈.2.反相HPLC在這一部分您將學(xué)習(xí):反相色譜機理.HPLC的應(yīng)用.關(guān)于反相色譜柱上的保留.HPLC如何選擇流動相.如何選擇反相色譜柱.反相分離的定義和機理OOOOSiSiOSiSiOOHOHOO固定相比流動相的極性小.HO機理

分配

固定相

十八烷基硅烷

辛基硅烷

氰基

氨基

C4

流動相

水

有機溶劑

緩沖液

改性劑

反相HPLC的應(yīng)用反相分離是下列應(yīng)用的首選方法:

分子量小于2000的中性、極性和非極性化合物.

同系物和苯系物.

弱酸弱減.

強酸強堿(離子對

HPLC).

蛋白質(zhì)和多肽.

很難分析:

胺

不溶于水的化合物22反相HPLC的保留順序不飽和COHOCOHHHNH2CHH水溶性增加>碳數(shù)支鏈胺,醛,酮醇酚保留作用增大保留最弱保留最強羧酸3OHCOHOCH31.3.2.4.預(yù)測流出順序OCCH2CH3OHOHOCCH2CH2CH3OHOCCH2CH2CH2CH3OCCH2CH2CH2CH2CH3OH1.2.3.4.洗脫強度水/緩沖液水甲醇乙腈異丙醇四氫呋喃用于HPLC的溶劑與水互溶

低黏度

低UV吸收

良好的溶解性能

不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)...乙腈（ACN）是最好的選擇反相HPLC中最好的有機溶劑?溶劑強度對譜帶間距離的影響100%乙腈（CAN）80%ACN60%ACN50%ACN40%ACN45%ACNmin.Time(min)mAU1100100080060040020010152060%甲醇40%水900700500300100Time(min)80070060050040030020010010152060%異丙醇40%水mAU101520140012001000800600400200Time(min)mAU60%乙腈40%水溶劑強度 u= 硫脲 P= propranolol BP= butylparaben DPP= 鄰苯二甲酸二丙酯 N= 萘 Ac= 二氫苊 A= amitriptyline流動相對譜帶間距離的影響

7-組分樣品ZorbaxXDB-C8選擇反相色譜柱

反相填料類型

球形或無定型顆粒

色譜柱硬件

柱內(nèi)徑

填料粒度

柱長

孔徑和體積

表面積

鍵合相密度

單體鍵合或聚合鍵合填料

封端或其他處理工藝當(dāng)選擇反相色譜柱時，請自己回答這些問題...反相色譜柱硅膠基SiOSiRCH3CH3R=CH2(CH2)16CH3C-18,

疏水性最強、保留最好、最耐用的色譜柱CH2(CH2)6CH3 C-8,耐用,保留作用比C18弱(CH3)3 C-3,C-4,蛋白質(zhì)和多肽,欠穩(wěn)定，保留作用弱CH2(CH2)2CH3 CNor(CH2)3CN 氰基,相當(dāng)耐用,最受歡迎的反相柱，適合于分離

混合官能團物質(zhì)NH2or(CH2)3NH2

胺,弱陰離子交換樹脂,糖分析柱

選擇性不同聚合物基 苯乙烯-二乙烯基苯共聚物pH1-13穩(wěn)定,柱效低一些300SB-C18條件:色譜柱:ZORBAX300SB,4.6x150mm

流動相:梯度,30min內(nèi)0-26%B.

A=含0.1%TFA的水

B=含0.1%TFA的乙腈

溫度:40°C

樣品:每種肽2μg

流速:1.0mL/min.

檢測:UV-210nm300SB-C8300SB-C3300SB-CN不同鍵合相上小肽的分離a數(shù)據(jù)引自商業(yè)文獻(xiàn)或制造商提供b對于硅膠類型說明見正文cNA=無數(shù)據(jù)色譜柱參數(shù)舉例00.020.040.060.080.10.120.140.160.180.2300SB-C18(300?)SB-C18(80?)PW1/2亮氨酸腦菲肽M.W.=556血管緊張素IIM.W.=1046胰島素BM.W.=3,496CytCM.W.=12,327核糖核酸酶M.W.=13,684溶菌酶M.W.=13,900孔徑和分子尺寸對峰寬的影響MW>4,000時，選擇大孔.單體鍵合相和聚合鍵合相+ClSiRCH3CH3SiOHSiOHSiOHSiOSiOSiOHSiRCH3CH3SiRCH3CH3單體鍵合SiOHSiOHSiOHClSiRClCl+H2OSiOSiOSiOH

SiRSiRSiOO聚合鍵合ROH

立體保護(hù)(不封端)經(jīng)典ODS傳統(tǒng)(不封端)傳統(tǒng)(封端)*

化學(xué)鍵的酸解離(水解)是可能的殘留硅醇基的處理-封端和立體保護(hù)相3.離子對RP-LC在這一部分您將學(xué)習(xí):如何用離子抑制劑控制弱酸性樣品的保留.如何使弱減樣品更容易分離.如何分離弱酸、弱減和中性化合物的混合物.如何用離子對HPLC分離強酸和強堿.弱酸的分離RCOH+H2ORCO

+H3O+OOORCOHORCO和pH=pKa高pHORCO保留最弱低pHORCOH保留最強保留作用隨pH的變化109876543210pHk’2486弱減弱酸pH=pKORCOHORCO緩沖液

pKa

緩沖范圍

緩沖液

pKa

緩沖范圍

磷酸 甲酸 3.8 2.8-4.8pK1 2.1 1.1-3.1 乙酸 4.8 3.8-5.8pK2 7.2 6.2-8.2 Tris(三羥甲基氨基甲烷)pK3 12.3 11.3-13.3 8.3 7.3-9.3 氨 9.2 8.2-10.2檸檬酸 硼酸 9.2 8.2-10.2pk1 3.1 2.1-4.1 吡咯烷 10.5 9.5-11.5pK2 4.7 3.7-5.7pK3 5.4 4.4-6.4緩沖液其他常用的流動相添加劑乙酸磷酸硫酸三氟乙酸(TFA)嗎啡、可待因和脫氫嗎啡的分離(a)(b)(c)(a)(b)(c)色譜柱A色譜柱B色譜柱C色譜柱A色譜柱B色譜柱C流動相:(a)80vol%,(b)40vol%,和(c)40vol%乙腈的水溶液,pH均為6，含有2mM乙酸鈉緩沖液.流動相:(a)16vol%,(b)10vol%,and(c)7vol%乙腈的水溶液;降低pH(3.5)并提高緩沖液濃度(25mM).LC-GC,6(1987)494緩沖液濃度色譜柱:4.6x150mmZorbaxXDB-C8;沖洗:20%ACN/80%0.25M緩沖液,pH7,1.0mL/min;測試:60%ACN/40%0.01M磷酸鈉緩沖液,pH7.0,1.5mL/min;22°C甲苯的理論塔板數(shù),cm0.0000.0020.0040.0060.0080.010阿米替林的理論塔板數(shù),cm0.0000.0020.0040.0060.0080.010用緩沖液沖洗的柱體積數(shù)050001000015000200002500030000用緩沖液沖洗的柱體積數(shù)050001000015000200002500030000磷酸磷酸檸檬酸TRIS磷酸檸檬酸TRIS緩沖液類型對色譜柱穩(wěn)定性的影響-Si-O-+R3NH+-Si-OH+R3N-Si-O-+HNR3-Si-O-+HNR3胺與硅醇基的相互作用---二次保留磷酸鈉（TEMED）哌嗪Minutes306090120150180建立了與殘留硅醇基的競爭緩沖液pH太低強相互作用阻斷劑作用不夠強三乙胺哌嗪TEMEDN,N,N’,N’,-四甲基乙二胺色譜柱:4.6x150mm,ZorbaxXDB-C8;流速:1.0mL/min;24°C流動相: A:55%甲醇/45%0.025M磷酸鈉緩沖液,pH3.0 B:55%甲醇/45%0.05M1-甲基吡啶-HCL緩沖液,pH11.0pH3pH11AB1321231阿米洛利2咖啡因3芐噻嗪024681020181614120.000.020.040.100.080.060.000.020.040.060.080.100.12保留時間（Min）弱減-不同pH條件下的分離利尿劑藥物常規(guī)硅膠柱封端硅膠柱封端色譜柱減少了二次保留作用酸性硅膠基體酸性較弱的硅膠基體條件:LC:HewlettPackardSeriesII1090儀器

色譜柱:ZorbaxEclipseXDB-C18,P/N:993967-902

流動相:ACN:pH6.0磷酸/檸檬酸緩沖液(10:90)緩沖液r:0.2MK2HPO4:0.1M檸檬酸(63:37)溫度:23°C;進(jìn)樣體積:10μL(0.1μg/μL);檢測UV:302nmZorbaxEclipseXDB-C18(4.6x150mm)

Flow=1mL/min.Originaltypeof

L1column(3.9x300mm)Flow=2mL/min.1212Rs=15.5Rs=10.8N=2400N=68001.葉酸(內(nèi)標(biāo)物)2.氨甲蝶呤用密集封端柱改善分離-分析氨甲蝶呤的美國藥典方法分離變量初始選擇色譜柱尺寸粒度鍵合相15(或25)x0.46cm5或3.5μmC18或C8流動相溶劑A和B%B緩沖液添加劑流速溫度樣品量體積質(zhì)量水相緩沖液/乙腈可變(k=0.5-20)25mM磷酸鉀,pH￡3需要時，25-50mMTEA或乙酸三乙胺1-2mL/min40°C￡50μL<25μg分離弱離子化化合物的初始實驗條件離子對反相HPLC分離強酸和強堿SO3SO3NRRRH+Na+鍵合相離子對試劑樣品N+N+OCROH2PO4用烷基磺酸鹽分離堿三氟乙酸(TFA)七氟丁酸(HFTBA)己烷磺酸用季胺烷基三乙基胺分離酸三乙胺(TEA)磷酸四甲基銨(TMA)磷酸四丁基銨(TBA)乙酸三乙基銨(TEAA)壬胺離子對反相HPLC分離陰離子流動相

A和B含有離子對試劑C和D是純緩沖液優(yōu)化離子對HPLC051015200204060烷基硫酸酯[mM]容量因子DECYLOCTYLHEXYLBUTYL優(yōu)化參數(shù)

流動相的

pH

離子對試劑濃度

離子對試劑選擇

流動相組成4.離子交換色譜（IEC）在這一部分您將學(xué)習(xí):離子交換HPLC分離機理.如何選擇離子交換固定相.流動相的pH如何影響分離結(jié)果.什么因素影響離子交換色譜的分離.離子色譜基礎(chǔ)知識.離子交換機理ClClHHH++++NH+NHCH2COOCH2COO機理

樣品離子可逆地結(jié)合到帶電固定相上固定相

磺酸鹽(SCX)

季胺(SAX)

羧甲基(WCX)

二乙基氨基乙基(WAX)流動相

流動相

對離子

有機改性劑

離子交換HPLC的應(yīng)用-銨和低分子量的胺-季胺化合物-鹵氧化物-弱有機酸-硅酸鹽-脂肪族和芳香族磺酸鹽-碳水化合物-氨基酸-蛋白質(zhì)-離子色譜能夠分離和檢測：痕量離子型物質(zhì)，如：F-,Br-,Cl-,NO2-,NO3-,HPO4-2,SO4-2,Li+,Na+,K+,Mg+2,Ca+2,Sr+2,Ba+2用于分離荷電分子:從小分子到蛋白質(zhì).固定相的官能團SO3SO3SO3Na+Na+Na+SCXCH2COONa+CH2COONaWCX++NCl+NClSAXWAX+NH+NHClCl強的離子交換劑在寬的pH范圍內(nèi)保持其帶電狀態(tài).弱的離子交換劑在有限的pH范圍內(nèi)保持其帶電狀態(tài).pH對樣品的影響OHH+N

HHCHCCH3COCH3OH+N

HHCHCCH3COCH3OH

NHCHCCH3COCH3凈電荷=+1凈電荷=0凈電荷=-1pH=1pH=6pH=11pk1=2.29pK2=9.72離子交換流動相對離子Mg2+>Ca2+>NH4+>Na+>K+陽離子交換陰離子交換SO4-2>HPO4-2>Cl->CH3COO-強陰離子交換劑pH<9弱陰離子交換劑pH<6強陽離子交換劑pH>3弱陽離子交換劑

pH>8水相緩沖液和/或鹽-任何常用的HPLC緩沖液(5mM到200mM) 鹽(0到1M)

完全離子交換容量的pH分離參數(shù):

流動相的

pH

對離子的選擇

對離子的濃度(離子強度)

有機改性劑

流速

溫度強陰離子交換分離蛋白質(zhì)

不同的離子強度控制洗脫能力.

常用梯度洗脫.1.F-2.HCO3-3.Cl-4.NO2-5.Br-6.NO3-7.PO4-38.SO4-2離子色譜-無機離子電導(dǎo)檢測器泵離子交換柱抑制柱或膜Na2CO3無機陰離子陰離子交換劑樹脂-H++Na+HCO3-

樹脂-Na++H2CO3HCl無機陽離子陽離子交換劑樹脂-OH-+H+Cl-樹脂-Cl-+H2O1.Li+2.Na+3.NH4+4.K+5.Ca2+6.Mg2+陰離子陽離子-離子色譜-單柱泵進(jìn)樣閥廢液流動池電導(dǎo)檢測器記錄儀色譜柱UV-檢測器單柱電導(dǎo)檢測器-使用很低容量的離子交換劑UV-檢測器-間接

UV檢測5.體積排阻色譜(SEC)在這一部分您將學(xué)習(xí):關(guān)于體積排阻色譜的不同應(yīng)用.

關(guān)于分離機理.

分離優(yōu)化提示.體積排阻色譜的原理機理:流出順序取決于分子的大小.固定相具有確定孔徑的交聯(lián)膠.必須與樣品無相互作用.流動相水相溶劑-凝膠過濾有機溶劑-凝膠滲透應(yīng)用日用品,增稠劑化妝品,穩(wěn)定劑,草藥制劑,藥物釋放控制建筑產(chǎn)品,涂料,水泥添加劑汽油,添加劑汽車輪胎,橡膠形變印刷產(chǎn)品,有機調(diào)色技術(shù)電子線路板,石印樹脂凝膠滲透凝膠過濾多肽蛋白質(zhì)酶核酸類酯類體積排阻色譜的一般應(yīng)用最常用于聚合物的平均分子量或分子量分布.提供復(fù)雜樣品的“指紋圖”，以區(qū)別“好”的和“壞”的材料.樣品純化方法.生物分子的定性和定量分析.分離小分子.SEC的原理BC響應(yīng)柱填料孔保留時間ABCA固定相的選擇保留時間孔徑太小孔徑太大選擇性滲透總排阻總滲透孔徑合適校準(zhǔn)-測定分子量2,610,000111,00039,00019,50015,30010,9001,50065分子量（MW）:保留時間(min)保留時間(min)VzVpVZVpVM色譜柱流動相體積隙間體積固定相孔體積聚合物洗脫體積VeGPCK聚合物可接觸體積Log(MW*黏度)GPC計算??Areai(Area/M)iiM=n數(shù)均分子量(AreaxM)ii??AreaiM=w重均分子量??AreaiM=v(AreaxM)iih1/h黏均分子量(AreaxM)ii??M=z(AreaxM)ii2Z-均分子量D=M/Mwn多分散性i(Area/Slope)iW=iArea/Slopeii?分子量分布Area=峰面積固定相的選擇分子量對數(shù)體積(ml)線性范圍10104105106107108102103100500100010,000100,0001,000,000MW基于孔徑選擇固定相()混合柱床將有較大的線性范圍.優(yōu)化GPC分離度選擇性柱效R=1/4Nx-1容量因子xk'1+k'分離度方程:XX

在固定相上

無保留

沒有分配作用，

但選擇合適的孔徑能夠影響選擇性

降低流速

增加柱長SEC優(yōu)化提示大的進(jìn)樣體積將導(dǎo)致分離度降低.保持進(jìn)樣體積為峰體積的5-10%.0.5%的流速變化會引起0.7%的分子量變化.溫度變化1oC引起分子量變化0.1%.分析在兩個柱體積內(nèi)完成.被分析物的黏度不應(yīng)大于溶劑黏度的2倍.分離性能隨流速降低而提高(也可防止大分子量聚合物的偏差).可能需要多根色譜柱,盡可能減小連接管死體積.要實現(xiàn)化合物之間的完全分離,其分子量起碼應(yīng)相差10%.GPC儀器要求

硬件精確的泵流速

保留時間精密度<0.1.%在線脫氣用預(yù)熱溶劑恒溫是色譜柱檢測器具有最低的短期和長期噪聲(波動)系統(tǒng)具有高的長期重現(xiàn)性耐用的自動進(jìn)樣器軟件在日常工作中容易使用與標(biāo)準(zhǔn)HPLC軟件組合在一起符合GPC標(biāo)準(zhǔn),如ISO/EN/DIN各種校準(zhǔn)方法自動的和交互的數(shù)據(jù)分析和報告用戶化報告(質(zhì)量百分比,分子量分布,曲線,校準(zhǔn)結(jié)果)1.請預(yù)測這些鄰苯二甲酸酯在正相色譜柱上的洗脫順序?鄰苯二甲酸二丁酯鄰苯二甲酸二甲酯鄰苯二甲酸二壬酯鄰苯二甲酸二乙酯5%四氫呋喃95%異辛烷作業(yè)2.如果將流動相改為5%甲苯和95%異辛烷，請預(yù)測色譜圖會有何變化?作業(yè)簡單敘述GC和HPLC分離中流動相所起的作用有何不同。反相HPLC分離甲苯、硝基苯、氯苯和苯，請預(yù)測出峰順序，并簡述理由。請列出色譜峰定性鑒定的主要方法（3種）是否可用HPLC分析天然氣的組成？為什么？

色譜類型選擇4.7、常見問題及分析1.色譜圖常見問題色譜圖常見問題主要有兩類:色譜峰峰形異常問題例如負(fù)峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對稱等色譜峰保留時間問題保留時間不穩(wěn)定等色譜峰峰形異常問題:色譜圖中未出峰:進(jìn)樣問題:未進(jìn)樣或樣品分解流動相問題:泵未輸液或流動相不正確檢測器設(shè)置不正確,或檢測器選擇有問題一個或幾個峰是負(fù)峰流動相吸收本底高進(jìn)樣過程中進(jìn)了空氣離子對分離中的系統(tǒng)峰樣品組分的吸收(RI或UV)低于流動相--峰比預(yù)想的要小樣品粘度過大進(jìn)樣器有問題或進(jìn)樣體積有誤檢測器設(shè)置不正確,定量環(huán)(Loop)體積不正確檢測器輸出未置零用了不正確的檢測器輸出信號檢測池被污染檢測器的燈可能有問題雙峰或肩峰進(jìn)樣量或樣品濃度過大保護(hù)柱或色譜柱進(jìn)口堵塞保護(hù)柱或色譜柱污染或失效拖尾峰保護(hù)柱或色譜柱問題:污染或失效進(jìn)樣問題樣品在洗脫劑中的溶解較差平頭峰檢測器設(shè)置不正確進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高色譜峰保留時間問題:保留時間飄忽不定(各次運行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或未達(dá)平衡泵壓力不穩(wěn)(泵頭里有氣泡)進(jìn)樣體積過大或樣品濃度過大溫度波動流動相混合不均勻色譜柱被污染保留時間增加或減少(各次運行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或化學(xué)平衡不足泵流速變化溫度變化色譜柱污染,柱效下降流動相被污染溶劑入口過濾器堵或管路堵塞系統(tǒng)滲漏2.HPLC常見問題系統(tǒng)壓力問題壓力高壓力低或沒有壓力壓力不穩(wěn)流路基線噪音問題基線不穩(wěn)定(不重復(fù))長、短程振蕩基線漂移噪音脈沖尖刺系統(tǒng)壓力問題壓力高的原因溫度太低流速太高流動相粘度大管路堵塞儀器或色譜柱堵塞壓力傳感器問題壓力低或沒有壓力溫度太高;流速太低泵關(guān)閉或保險絲斷了泵未輸送流動相儲液瓶中無溶劑低壓限設(shè)置不當(dāng)泵未正確排氣

溶劑入口過濾頭堵入口管路中有空氣系統(tǒng)內(nèi)有滲漏處所用溶劑不正確壓力不穩(wěn)壓力傳感器問題泵排氣不充分泵失效流動相未正確脫氣所用溶劑不混溶或易揮發(fā)流路基線噪音問題基線不穩(wěn)定(不重復(fù))檢測池中有大的氣泡流路中有小氣泡流過系統(tǒng)未穩(wěn)定或未達(dá)到平衡流動相被污染檢測器流動池漏色譜柱污染基線漂移系統(tǒng)不穩(wěn)或未達(dá)平衡溫度波動流動相未正確脫氣流動相被污染;流動相中有穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑變化檢測器流動池漏;系統(tǒng)中有滲漏色譜柱污染;固定相滲漏選用不正確的檢測波長(相對于溶劑)有遲流出的組分第七節(jié)儀器的日常養(yǎng)護(hù)（1）手柄處于Load和Inject之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過高的壓力引起柱頭損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途。（2）在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。1.六通閥進(jìn)樣器的保養(yǎng)（3）使用定量環(huán)的定量：六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75%，如20μL的定量環(huán)最多進(jìn)樣15μL的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μL的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100μL的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。（4）進(jìn)樣樣品要求無微粒和能阻死針頭及進(jìn)樣閥的物質(zhì)，樣品溶液均要用0.45μm(0.22μm)

的濾膜過濾。防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側(cè)。進(jìn)樣器停機后要用沒有緩沖鹽的溶劑沖洗干凈進(jìn)樣器內(nèi)殘留的樣品和緩沖鹽，防止無機鹽沉積和樣品微粒造成閥轉(zhuǎn)子面磨損或阻塞，絕對不能用氣相色譜那樣的尖針頭進(jìn)樣。（1）色譜柱的平衡

反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。一定確保所使用的流動相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運輸過程中可能會干掉，因此在用流動相分析樣品之前，應(yīng)使用10～20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過渡”。切忌直接用甲醇置換緩沖液

2.色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動相，請在使用流動相之前用乙醇或異丙醇平衡

每天用足夠的時間來平衡色譜柱，一定要做?。?/p>

如何平衡？

平衡過程中，將流速緩慢地提高；用流動相平衡色譜柱直至獲得穩(wěn)定的基線表1建議用來沖洗的溶劑體積色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積（20倍）125mm-4.6mm1.6ml30ml250mm-4.6mm3.2ml60ml250mm-10mm~20ml400ml2.色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)（1）盡量使用預(yù)柱和保護(hù)柱來保護(hù)分析柱（2）柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動（3）避免使用高粘度的溶劑作為流動相（4）避免流動相組成及極性的劇烈變化（5）流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理（6）大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－8，盡量不超過該色譜柱的pH范圍（7）注意每根色譜柱的柱壓上限，嚴(yán)禁在上限壓力下工作（8）嚴(yán)格控制進(jìn)樣量，并盡量用流動相溶解樣品（9）避免樣品閥扳動過慢造成柱壓大的波動（10）壓力升高可能是需要更換預(yù)柱的信號（11）每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?約20倍）,并保存在適當(dāng)溶劑中（C18在甲醇)；當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)先用無鹽流動相沖洗。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜止過夜或更長時間。(12）一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。（13）若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉

3.泵的維護(hù)與保養(yǎng)（1）使用的流動相盡量要清潔；（2）進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；（3）流動相交換時要防止沉淀；（4）每天開始使用儀器，注意放空排氣，確保泵頭、流動池以及其他流路系統(tǒng)中無氣泡;（5）避免泵啟動過速、升壓過快4.檢測器的保養(yǎng)（1）紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、色譜柱平衡得差不多時，再打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。（2）樣品池也要保養(yǎng)(流動相干凈，樣品不能太臟）。

使用HPLC純?nèi)軇┻^濾裝置真空使用小于0.45μm過濾膜防止固體顆粒損傷儀器或柱頭溶劑準(zhǔn)備

不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長菌的溶劑會阻塞溶劑過濾器，降低泵的操作性能。使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌。用濾膜過濾溶劑去除微生物。每兩天更換或過濾溶劑。避免溶劑瓶直接日照。溶劑脫氣目的：排除溶解在流動相中的氧氣和氮氣平衡柱子確保分析結(jié)果再現(xiàn)性對于反相柱使用5～10倍柱體積流動相平衡色譜柱柱平衡預(yù)柱和保護(hù)柱從泵來的流動相預(yù)柱進(jìn)樣口保護(hù)柱分析柱至檢測器預(yù)柱針對流動相來保護(hù)色譜柱色譜柱保護(hù)過濾所有的溶劑和樣品使用保護(hù)柱儀器使用完畢，沖洗整個系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中緩沖液柱子在不使用時，兩端密封保存在適當(dāng)?shù)娜軇┲斜４嬷幼⒁馍V柱的pH值使用范圍不要高壓沖洗柱子不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相樣品準(zhǔn)備樣品完全溶解在流動相中樣品沒有完全溶解過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒流動相或比流動相弱的溶劑溶解樣品進(jìn)樣量盡量小方法開發(fā)在這一部分您將學(xué)習(xí):如何逐步開發(fā)HPLC方法.

收集數(shù)據(jù)

選擇固定相

準(zhǔn)備樣品

進(jìn)行分析

優(yōu)化開發(fā)新HPLC方法的主要步驟收集數(shù)據(jù)優(yōu)化?選擇固定相驗證準(zhǔn)備樣品準(zhǔn)備儀器!第一次HPLC運行收集有關(guān)樣品的信息

溶解性

檢測可能性

離子化特征

摩爾質(zhì)量

樣品數(shù)據(jù)/基質(zhì)

定量分析

預(yù)期檢測限

預(yù)期定量限

內(nèi)標(biāo)化合物?

標(biāo)準(zhǔn)樣品

空白基質(zhì)定性分析

標(biāo)準(zhǔn)樣品

空白基質(zhì)

數(shù)據(jù)收集數(shù)據(jù)收集巴比妥鹽巴比妥MW=184.19阿洛巴比妥MW=208.21阿普比妥MW=210.23苯巴比妥MW=232.23異丁比妥MW=234.23環(huán)戊巴比妥MW=234.24布他比妥MW=224.25海索比妥MW=236.26異戊巴比妥MW=226.27MW=209.24甲苯比妥ONHOOHNONHOOHNONHOOHNONHOOHNNa+ONHOOHNONHOOHNONHOOHNOOOHNONHOOHNONHOOHNN數(shù)據(jù)收集什么化合物參數(shù)能用于分離?

分子量不同

/MW>2000 凝膠滲透

/凝膠過濾

離子化分子

離子對/離子交換

極性不同

吸附/反相色譜

同系物/苯系物

反相

中性、酸和堿的混合物 反相

生物分子

親和/HIC/凝膠過濾/反相

立體異構(gòu)體

吸附

手性化合物

手性色譜結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)收集?固定相和流動相選擇選擇初始色譜柱?固定相選擇選擇色譜柱:固定相柱直徑柱長填料粒度孔徑對于一般到較難的分離，典型的初始色譜柱為:4.0-4.6x150-250mm,3.5-5μm填料80-120?孔徑(小分子)儀器選擇泵

等梯度或梯度

流速和組成精度要求流速范圍(分析或制備)

連接管

金屬或特殊材料

低擴散

柱箱和切換閥

檢測器

靈敏度

選擇性

定量性

回收230250270290波長(nm)pH2.0pH>10pH10相對吸光度注意：樣品的UV特征可能隨流動相pH的變化而變化樣品-預(yù)處理基質(zhì)數(shù)據(jù)固體樣品液體樣品復(fù)雜基質(zhì)未知基質(zhì)液-液萃取*固相萃取(SPE)*沉淀-離心*過濾稀釋過濾微透析*冷凍干燥*溶解和過濾?樣品準(zhǔn)備樣品預(yù)處理樣品準(zhǔn)備的目的是為進(jìn)樣純化樣品.完成純化的方法有:

過濾-有不同孔徑的過濾材料.

提示:有的化合物可能吸附在過濾器上，從而影響定量.

離心-

可除去樣品中的顆粒物質(zhì).樣品準(zhǔn)備樣品處理-固相萃取(SPE)固相萃取的目的是將被分析物與基質(zhì)化合物分離開.樣品準(zhǔn)備液體通過固相,(LC原理)選擇性地洗脫被分析物或即基質(zhì)化合物.基質(zhì)化合物和被分析物均可用不同的溶劑洗脫，而另一個則保留.樣品處理-固相萃取(SPE)SPE步驟:1.預(yù)處理小柱2.加樣3.沖洗4.洗脫5.收集6.濃縮7.過濾樣品準(zhǔn)備樣品處理-液-液萃取采用兩種互不相溶的溶劑分離樣品化合物.基于溶解性不同實現(xiàn)分離.樣品準(zhǔn)備樣品處理-稀釋-揮發(fā)稀釋

用一種互溶的且比流動相弱的溶劑或流動相本身稀釋樣品.揮發(fā)

采用惰性氣體