第14章維生素類藥物的分析

第十四章維生素類藥物的分析Chapter14

AnalysisofVitamins基本要求1、掌握維生素A、B1、C、E的化學結構、理化性質以及與分析方法間的關系，它們的專屬鑒別反應、主要的含量測定方法與原理。2、掌握維生素A、B1、C、E的有關物質、檢查方法與原理。3、了解維生素D的性質和分析特點。

維持人類機體正常代謝功能所必須的一類活性物質，主要用于機體的能量轉移和代謝調(diào)節(jié)，體內(nèi)不能合成，須從食物中攝取。

通俗來講，即維持生命的物質，是維持人體生命活動必須的一類有機物質，也是保持人體健康的重要活性物質。維生素在體內(nèi)的含量很少，但不可或缺。維生素醇從化學結構上來講，維生素類均屬于有機化合物，但并非同一類化合物。酯酸胺酚醛各具有不同的理化性質和生理作用維生素按溶解度分生物法微生物法化學法物理化學法維生素類藥物的分析方法都是依據(jù)藥物的化學結構、理化性質與生物特性來進行分析-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A結構特點：（1）環(huán)己烯+共軛多烯側鏈；（2）天然VA側鏈為全反式；（3）天然來源主要是魚肝油，為醋酸酯，棕櫚酸酯等,目前多由人工合成。

一、性質properties1.溶解性：

不溶于水，溶于乙醚，氯仿，環(huán)己烷或石油醚、植物油等。Solubility:insolubleinwater；solubleinether,chloroform,cyclohexaneorpetroleumether，vegetableoil

etc.

2.

不穩(wěn)定性△或金屬離子instability:light--catalysedcrackingreactionredoxreaction(oxidizedbyoxygeninair,orotheroxidizingagents)▲?。h(huán)氧化物

epoxides▲

ⅱ．維生素A醛aldehyde▲

ⅲ．維生素A酸acid具有共軛多烯側鏈—紫外吸收，最大吸收波長在325~328nm，可用于鑒別和含量測定。3.紫外吸收ultravioletabsorptionconjugatedpolyenemaximumabsorptionwavelength：325~328nm4.與三氯化銻發(fā)生呈色反應reactionwithSbCl3(Carr-Pricereaction)CHCl3二、鑒別試驗Identification（一）三氯化銻反應（Carr-Price反應）無水、無醇藍色紫色insaturatedchloroformsolution,water,alcohol-free（二）UV法326nm348nm367nm389nmVitA去水VitA（VitA3）↓（三）

TLC（BP、USP）確認醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯?！篤A和其標準品用氯仿溶解（USP34）展開劑：環(huán)己烷—乙醚（80：20）板：硅膠顯色：磷鉬酸Rf：VA醇0.1VA醋酸酯0.45VA棕櫚酸酯0.7維生素A的測定CHP收載三種HPLC法UV三氯化銻法三、含量測定Assay立體異構體氧化降解產(chǎn)物合成中間體（一）UV法三、含量測定Assay維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸t(yī)hree-pointcorrectionprocedure（三點校正法）three-wavelengthcorrectionprocedure

1.原理：（1）雜質的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減小；（2）物質對光的吸收具有加和性。Supposition：I.theirrelevantabsorption:islinearbetween310~340nmwavelenghs(atthethreewavelenghsselected)II.thetotalabsorbanceofthemixtureisthesumoftheindividualabsorbanceofcomponentsAt=AVA+Ai2.波長的選擇：（1）1—VitA的max（328nm）（2）2、3—分別在1的兩側第一法等波長差法—VitA醋酸酯=12nm第二法等吸收比法—VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm（1）基本步驟:第一步

A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質的干擾已基本消除測定法第二步求注意：

C為混合樣品的濃度

換算因子由純品計算而得：第三步求效價第四步求標示量％

方法：（2）測定法第一法直接測定法適用于純度高的維生素A醋酸酯?。畲笪詹ㄩL確認

max在326~329nm，第一法測定。max不在326~329nm，第二法測定。ⅱ．計算吸收度比及比值差均不超過±0.02，用A328直接計算。有一個以上超過±0.02，計算A328（校正），先判斷再計算。ⅲ．計算校正吸收度03%－15%－3%第二法第二法

VitAD膠丸中VitA的含量測定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為A300：0.374A316：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中維生素A占標示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637A328(校正)–A328(實測)A328(實測)×100％E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.870.637–0.6630.663×100％=-3.92％=供試品中維生素A效價=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標示量%=VA效價(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%第二法（等吸收比法）[皂化法、6/7A法]第一法無法消除雜質干擾時用此法水溶性脂溶性

方法：ⅰ．最大吸收波長確認

max在323~327nm，計算A300/A325。max不在323~327nm，取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定。ⅱ．計算吸收度比值A300/A325＞0.73，取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定≯0.73，計算A325（校正）后，再判斷計算ⅲ．計算校正吸收度03%－3%儀器與色譜條件

HPLC,紫外檢測器色譜柱：硅膠

流動相：正己烷-異丙醇（997:3）檢測波長：325nm（二）HPLC法測定法

外標法適用范圍

維生素A醋酸酯原料及其制劑中維生素A的含量（三）三氯化銻比色法λmax618nm～620nm缺點呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標準曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性藍色+3SbClVitASbCl3colorimetricmethod:第二節(jié)維生素E一、結構與性質***名稱R1R2相對活性α-生育酚CH3CH31.0β-生育酚CH3H0.5γ-生育酚HCH30.2δ-生育酚

HH0.1苯并二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈dl－α－生育酚醋酸酯1.溶解性黃色液體，無水乙醇、丙酮、乙醚植物油中易溶2.水解性3.氧化性：遇光、空氣氧化4.UV：無水乙醇液284nm，E為41.0~45.0[O]△游離生育酚-+orOHHVitE醌型化合物（一）硝酸反應nitricacidreaction(redoxreaction)二、鑒別75℃15′HNO3VitE乙醇橙紅色Identification生育酚HNO3（橙紅色）生育紅對-生育醌（二）三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應血紅色=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中（三）UV法（四）其他方法TLC、GC、HPLC、IR三、雜質檢查Test（一）酸度acidity

目的：檢查制備過程中引入的游離醋酸。方法：乙醇乙醚為溶劑，酚酞為指示劑，以NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，體積控制，不得過0.5ml。（二）游離生育酚Testoffreetocopherol

利用生育酚的強還原性，規(guī)定所消耗的硫酸鈰液（0.01mol/L）不得超過1.0ml。CH.P

取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml。p-tocopherquinonefreetocopherol（M生育酚=430.8）滴定度的計算限量的計算（三）有關物質方法：GC—主成分自身對照法限量：α-生育酚（1.0%）其他單個雜質峰（1.5%）各雜質峰總和（2.5%）（四）殘留溶劑天然型維生素E檢查正己烷。四、含量測定（一）GC法（ChP法定方法）

內(nèi)標法(正三十二烷為內(nèi)標)維生素E原料及其制劑均采用本法測定（二）其他方法

HPLC法（JP15）鈰量法比色法熒光法1．中國藥典（2010年版）采用以下何法測定維生素E含量A.酸堿滴定法B.氧化還原法C.紫外分光光度法D.氣相色譜法E.非水滴定法2．維生素A的鑒別試驗為A.三氯化鐵反應B.硫酸銻反應C.2,6-二氯靛酚反應D.三氯化銻反應E.間二硝基苯的堿性乙醇液反應3．中國藥典（2010年版）規(guī)定維生素A的測定采用紫外分光光度法（三點校正法），此法又分為A．等波長差法B．等吸收度法C．6/7A法D．差示分光法E．雙波長法4．維生素E的鑒別試驗有A．硫色素反應B．硝酸氧化呈色反應C．硫酸-乙醇呈色反應D．堿性水解后加三氯化鐵乙醇液與2,2-聯(lián)吡啶乙醇液呈色反應E．Marquis反應

維生素A與

反應即顯藍色，漸變成紫紅色；反應需在

條件下進行。

維生素E在酸性或堿性溶液中加熱可水解生成游離

，當有氧或其他氧化劑存在時，則進一步被氧化成醌型化合物，尤其在堿性下更易發(fā)生。第三節(jié)維生素B1HClCl-一、結構與性質1、溶解性2、硫色素反應3、UV(246nm，E為406~436)4、與生物堿沉淀試劑反應5、氯化物特性VitaminB1

Thiaminehydrochloride一、結構與性質

干燥品在空氣中迅速吸收4%的水分。在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶，水溶液呈酸性溶解性噻唑環(huán)在堿性介質中可開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合，經(jīng)鐵氰化鉀等氧化劑氧化成具有熒光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈藍色熒光。硫色素反應

嘧啶環(huán)、噻唑環(huán)具有紫外吸收特性，246nm，吸收系數(shù)為406~436（12.5μg/ml鹽酸溶液）。紫外吸收特性分子中具有兩個雜環(huán)，可與某些生物堿沉淀試劑如碘化鉀、三硝基苯酚、碘溶液、硅鎢酸反應生成恒定的沉淀。生物堿沉淀試劑反應維生素B1為鹽酸鹽，可呈氯化物的鑒別反應。氯化物特性

硫色素熒光反應

沉淀反應

氯化物反應硫元素反應紅外分光光度法其他二、鑒別試驗

Identification（一）硫色素反應thiochromereaction（ChP）方法：取本品約5mg，加NaOHT.S.2.5ml溶解后，加鐵氰化鉀T.S.0.5ml與正丁醇5ml，強力振搖2min，放置使分層，上層顯強烈的藍色熒光；加酸使呈酸性，熒光即消失；再加堿使呈堿性，熒光又重現(xiàn)。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應Precipitationreaction

（三）其他反應PbSNaSVitB1Pb(NO3)2NaOHS:Cl:

非水溶液滴定法(ChP2010，原料藥)

紫外分光光度法(ChP2010

，片劑注射劑)

硫色素熒光法(USP34-NF29)三、含量測定（一）非水溶液滴定法Non-aqueoustitration

醋酸汞試液

指示劑：喹那啶紅－亞甲藍（紫紅→天藍）2005版醋酐為溶劑

指示終點：電位法2010版（二）UV法246nm266nm233nm1.直接測定法2.差示分光光度法WEA%cmD10011××%100標示量平均片重××片劑、注射劑=421（每片）相當于標示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChP維生素B1片的含量測定：

取維生素B1片20片，精密稱定，其總重量為2.3695g，研細，精密稱取細粉0.3608mg，置100ml量瓶中，加鹽酸溶液（9→1000）約70ml，振搖15min使維生素B1溶解，加鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，搖勻。用干燥濾紙濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加鹽酸溶液(9→1000)稀釋至刻度，搖勻。照分光光度法（附錄ⅣA），在246nm的波長處測定吸收度A為0.615，已知維生素B1的吸收系數(shù)（E）為421，維生素B1標示量=10mg/片，計算維生素B1的標示百分含量。(P360)（每ml）相當于標示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm100110011××標示量稀釋倍數(shù)×維生素B1注射劑的含量測定：精密量取維生素B1注射液1ml（約相當于維生素B150mg），置200ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取5ml，置100ml量瓶中，加鹽酸溶液(9→1000)稀釋至刻度，搖勻。照分光光度法（附錄ⅣA），在246nm的波長處測定吸收度A為0.518，按C12H17ClN4OS·HCl的吸收系數(shù)（E）為421計算標示百分含量。（標示量為2ml:100mg）VitB1鐵氰化鉀NaOH硫色素異丁醇熒光λex-365nmλem-435nm+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇對照液+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇供試液SdAb（三）硫色素熒光法第五節(jié)維生素CL－抗壞血酸L-Ascorbicacid一、結構與性質1、溶解性2、酸性acidicbehavior3、還原性reducingaction4、旋光性5、水解性hydrolysis6、糖類的性質7、UV1、易溶于水在乙醇中略溶、在氯仿或乙醚中不溶2、水溶液呈酸性溶解性▲C3-OH，pKa=4.17(共軛效應)▲C2-OH，pKa=11.57(鄰位羰基)一元酸，能與NaHCO3作用生成鈉鹽。烯二醇結構dienolgroup還原性烯二醇結構二酮基結構烯二醇結構有活性有活性無活性L-二酮古洛糖酸D(-)-異抗壞血酸L(+)-異抗壞血酸L(+)-抗壞血酸D(-)-抗壞血酸旋光性水解性△糖類的顯色反應50℃結構與糖類相似具糖的性質UV特征

氧化還原反應

糖類反應

紫外光譜薄層色譜其他二、鑒別試驗

Identification612345（一）與氧化劑的反應oxidationreaction去氫抗壞血酸[O]VitCAgNO3反應2，6-二氯靛酚其他氧化劑1.與AgNO3反應silvernitratereaction(ChP2010)2.與2,6-二氯靛酚反應2,6-dichloroindophenolreaction

氧化型玫瑰紅色藍色OHˉ還原型無色3.其他氧化劑的反應：亞甲藍、高錳酸鉀、溴水試劑褪色

堿性酒石酸銅（斐林試劑）磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍（二）糖類的反應藍色Furfural(dehyde)reaction50℃三氯化醋酸orHCl藍色戊糖糠醛（三）TLC(ChP2010)

供試品溶液：VC泡騰片，水溶解后過濾

對照品溶液：VC1mg/ml

硅膠GF254

流動相：乙酸乙酯-乙醇-水（5:4:1）紫外燈（254nm）下視檢

供試品所顯主斑點的位置和顏色應與對照品溶液的主斑點相同。（四）UV(BP2010)0.01mol/LHCl三、雜質檢查1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質分光光度法—比較法2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法，標準添加對照法3.草酸的檢查：與鈣反應，對照法

碘量法

二氯靛酚滴定法

高效液相色譜法紫外分光光度法其他612345四、含量測定

Assay

1、原理：在酸性溶液中，以淀粉為指示劑，用碘液直接滴定。（一）碘量法(

Iodimetry)ChP2010H+

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當于8.806mg的C6H8O6。2、方法3、討論（1）新沸冷H2O：減少水中溶解的O2（2）酸性環(huán)境：減慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定：減少O2的干擾（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5

OaS3aSO+H2NHON225HCHOOHH2CSO3Na（二）2，6-二氯靛酚鈉滴定法

(2,6-dichloroindophenoltitration)原理1、去氫抗壞血酸＋酚亞胺VitC＋2,6—二氯靛酚自身指示終點法終點由無色到玫瑰紅色方法2、終點：溶液顯玫瑰紅色，并持續(xù)5秒不褪色。討論3、（1）酸性環(huán)境：穩(wěn)定VitC（2）快速滴定2min內(nèi)：防止其他還原性物質干擾（3）2,6—二氯靛酚滴定液不穩(wěn)定，儲備液不宜超過一周。（4）專屬性較碘量法高，多用于制劑的含量測定。如：USP32、JP15

維生素A1、掌握維生素A的三點校正紫外分光光度法；2、熟悉維生素A的三氯化銻反應及其比色法；維生素B13、掌握維生素B1的硫色素反應；了解維生素B1的硫色素熒光法4、熟悉維生素B1的非水滴定法及片劑與注射劑的紫外分光光度法的測定原理、含量％、標示量％的計算方法；維生素C6、掌握維生素C的碘量法；7、熟悉維生素C的鑒別試驗方法和2，6—二氯靛酚滴定法原理；8、了解維生素C的雜質檢查項目；維生素E9、熟悉維生素E的鑒別試驗方法、雜質游離生育酚檢查原理與限度％計算法；小節(jié)1.維生素B1的鑒別方法是：A.三氯化鐵反應B.硫色素反應C.柯柏反應D.與堿性酒石酸銅試液反應E.雙縮脲反應練習與思考[A型題]2.下列藥物的堿性溶液，加入鐵氰化鉀后，再加正丁醇，顯藍色熒光的是：A.維生素AB.維生素B1

C.維生素CD.維生素DE.維生素E3．既具有酸性又具有還原性的藥物是：A.維生素AB.咖啡因C.苯巴比妥D.氯丙嗪E.維生素C4．在三氯醋酸或鹽酸存在下，經(jīng)水解、脫羧、失水后，加入吡咯即產(chǎn)生藍色產(chǎn)物的藥物應是A.氯氮卓B.維生素AC.普魯卡因D.鹽酸嗎啡E.維生素C5：測定維生素C注射液的含量時，在操作過程中要加入丙酮，這是為了A.保持維生素C的穩(wěn)定B.增加維生素C的溶解度C.使反應完全D.加快反應速度E.消除注射液中抗氧劑的干擾[B