常用分子生物學(xué)試劑的選擇中文

常用分子生物學(xué)試劑的選擇中文第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日用于分子克隆的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA連接酶

核酸酶

核酸修飾酶第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日如何選擇最合適的限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能

主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈細(xì)菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)異源三聚體多功能同源二聚體異源二聚體距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割旋轉(zhuǎn)對稱序列TGAN8TGCTAACN6GTGC距識(shí)別序列下游24-26bp處識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割GAGCC限制性核酸內(nèi)切酶的類型限制性核酸內(nèi)切酶單功能雙功能ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶屬名種名株名Haemophilunitssinflunitsenzae

d

嗜血流感桿菌d株HindIII同一菌株中含多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶,表示在該菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)EcoRI的切割位點(diǎn)EcoRI的識(shí)別序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日EcoRI等產(chǎn)生的5’粘性末端

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’OHPOHP退火4-7℃第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日PstI等產(chǎn)生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHPOHP第九頁，共四十一頁，2022年，8月28日PvunitsII等產(chǎn)生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvunitsII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10units酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時(shí)間措施：第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、

BglII、Saunits3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘PunitsPunitsATPyPy3’或者5‘AATT3’影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日星號(hào)活性

在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,也能切割一些與其特異識(shí)別序列類似的序列。在酶的名稱右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示,如EcoRⅠ*。必須采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟,堅(jiān)持應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日同裂酶(isoschizomer)或異源同工酶:不同來源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaunitsdiners)：來源不同、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的酶。遠(yuǎn)距離裂解酶(distantcleavage)：識(shí)別位點(diǎn)與切割位置不一致可變酶：識(shí)別序列中的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸是可變的Sunitsbset酶：一種酶的識(shí)別序列包含于另一些酶的識(shí)別序列之中第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日

酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)價(jià)格昂貴的酶決不能用水稀釋,以免變性失活。預(yù)先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復(fù)凍融。使用無菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會(huì)抑制酶活性。

第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日常用內(nèi)切酶的單位價(jià)格比較

產(chǎn)品名稱公司規(guī)格價(jià)格單位價(jià)格BamHIN50002800.056T20001200.06P25002600.104BglIIN10002800.28T5001200.24P5002280.456DpnIN5003100.62T

P2003841.9175HindIIIN50002800.056T30001200.04P50001560.03NdeIN20003100.115T4002000.5P5007411.482第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日如何選擇最合適的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR

實(shí)驗(yàn)的不同需求第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日DNA聚合酶的特性純度穩(wěn)定性酶活性第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日PCR

實(shí)驗(yàn)的不同需求長片段擴(kuò)增PCR試劑盒

擴(kuò)增效率

保真性

特異性

基因組擴(kuò)增、RT-PCR

基因篩選、測序、基因克隆

復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級結(jié)構(gòu)）構(gòu)建基因圖譜、測序、分子遺傳學(xué)

復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)?；驒z測第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日特異性－熱啟動(dòng)Taq酶原理

蠟封抗體抑制化學(xué)修飾特點(diǎn)

避免非特異性擴(kuò)增提高PCR反應(yīng)的特異性用途

基因組擴(kuò)增

RT-PCR第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶

廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶Invitrogen10966-018100rxn1,0505u/ul，用于提高聚合酶鏈反應(yīng)特異性的自動(dòng)“熱啟動(dòng)”Invitrogen10966-026250rxn2,510Invitrogen10966-034500rxn4,540MBIER0601100u600

TakaraDR007A250u350適用于HotStartPCR法擴(kuò)增DNA和DNA序列測定。TakaraDRR006A250u550SGB0095-100U

100u300HeatstartTaqSG

B0095-200U

200u540SGB0095-500U

500u1,100TiangenET102-01250u200超純特異性最強(qiáng)的耐熱DNA聚合酶TiangenET102-02500u380第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日保真性—高保真酶原理用途

表達(dá)基因的克隆基因的定點(diǎn)突變細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（SNP）

3’-5’核酸外切酶活性降低堿基錯(cuò)配率

第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶

廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

高保真DNA聚合酶Invitrogen12344-024200rxn3,180AccPrimePfxDNA聚合酶，具有高產(chǎn)量和高特異性的特高PCR保真度，為普通Taq的26倍，可擴(kuò)增12kbDNA。PCR優(yōu)化最小化。Invitrogen12344-0321000rxn15,070

Invitrogen12344-040200rxn3,980AccPrimePfxSuperMix，同上。Invitrogen12346-086200rxn3,210AccuPrimeTaq，具有高特異性和高產(chǎn)量的高保真度PCR，為普通Taq的9倍，可擴(kuò)增20kbDNA。PCR優(yōu)化最小化。Invitrogen12346-0941000rxn14,270Invitrogen11304-011100rxn1,610PlatinumTaq，5u/ul，RobustPCR擴(kuò)增具有高產(chǎn)量,保真度為普通Taq的6倍，可擴(kuò)增20kbDNA。室溫反應(yīng)組裝。Invitrogen11304-029500rxn7,140Invitrogen11304-1025000rxn60,010Invitrogen12532-016100rxn2,270PlatinumPCRSuperMix，1.1X，同上。MBIK0191100u398HighFidelityPCREnzymeMix,可擴(kuò)增10-20kbDNA。TakaraDRR100A250u280ExTaq,比普通Taq擴(kuò)增效率高，保真度為其4倍。TakaraDR006A200u600Z-Taq,反應(yīng)速度約為普通Taq的5倍，保真度為3倍。TakaraDR005A125u400PyrobestDNAPolymerase,保真度為普通Taq的10倍。第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日高保真＋

高擴(kuò)增效率原理

混合酶－高擴(kuò)增效率－3’－5’核酸外切用途

超長片段擴(kuò)增

－測序

－構(gòu)建基因圖譜

復(fù)雜模板擴(kuò)增－GC含量高－二級結(jié)構(gòu)第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日PfunitsDNA聚合酶MBIEP0571100units545native,blunitsnt-endPCRprodunitsct,Errorrate:2.6x10-6MBIEP0501100units198recombinant,Errorrate:2.6x10-6PromegaM7741100units2–3units/μlSBSEP-500500units200耐熱，尤其適用于高保真擴(kuò)增長度為3kb以下的片段SGB0093-100units

100units60SGB0093-200units

200units100

SGB0093-500units

500units200SGB0094S-100units

100units120SunitsperPfunitsSGB0094S-200units

200units220SGB0094S-500units

500units450

Stratagene600135100units1250native;高保真vsTaq:6X;<10KbStratagene600153100units1200cloned;高保真vsTaq:6X;<10KbTiangenEP101-01250units150超純高保真耐熱DNA聚合酶，配有10×PfunitsBunitsfferTiangenEP101-02500units280Pfunits熱啟動(dòng)

DNA聚合酶Stratagene600390100units1,500熱啟動(dòng);高保真vsTaq:20X;<19KbPhunitssionDNAPolymeraseNEBF-530S100units1,250高保真vsTaq:50X;Template:20Kb

PhunitssionHotstartDNAPolymeraseNEBF-540S100units1,500熱啟動(dòng);高保真vsTaq:50X;20KbVentDNAPolymeraseNEBM0254V100units310高保真vsTaq:5XNEBM0254S200units696DeepVentDNAPolymeraseNEBM0258V100units445高保真vsTaq:>6X產(chǎn)品名稱

廠商及貨號(hào)

規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日PhunitssionDNAPolymeraseNEBF-530S100units1,250長片段高保真;高保真vsTaq:50X;Template:20Kb

PhunitssionHotstartDNAPolymeraseNEBF-540S100units1,500熱啟動(dòng);高保真vsTaq:50X;20Kb

LongPCREnzymeMixMBIK0181100units3985units/unitsl,可擴(kuò)增21-47kbLongPCRControlSetMBIK020125rxn398test20-30kbPCRfragmentsExpandLongTemplatePCRSystemRoche11681834001150units1,400HunitsmangenomicDNA:5-27Kb

AccunitsTaqLADNAPolymeraseSigmaD8045-125unitsN125units1,300高保真vsTaq:6.5X;genomicDNA:<20Kb

JunitsmpStartAccunitsTaqLADNAPolymeraseSigmaD5809-125unitsN125units1,550HotstartPCREXLDNAPolymeraseStragagene600340100units1,200高保真

vsTaq:3X;GenomicDNA:<37Kb;vectorDNAtemplate:<50KbPfunitsunitsltraIIFunitssionHSDNAPolymeraseStratagene60067040rxn1,250GenomicDNA:<19Kb;cDNA:<9.6KbPfunitsunitsltraHotstartDNAPolymeraseStratagene600390100units1,500熱啟動(dòng);高保真vsTaq:20X;<19KbEXTaqTaKaRaDRR001A250units350GenomicDNATemplate:<20KbLATaqTaKaRaDRR002A125units300GenomicDNATemplate:<20Kb，

保真度為普通Taq的7倍。V-TaqSBSEVT-500500units260V-Taq,尤適合復(fù)雜長片段擴(kuò)增,能擴(kuò)增10kb

的動(dòng)植物基因組DNA和20kb的LambdaDNA。超純長片段擴(kuò)增耐熱DNA聚合酶TiangenET103-01250units150配有10×LongTaqBunitsffer超純長片段擴(kuò)增耐熱DNA聚合酶TiangenET103-02500units280TaqDNAPolymerase10xReactionBunitsfferPromegaM1881750unitsl50withMgcl2

產(chǎn)品名稱

廠商及貨號(hào)

規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日PCR

MasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液

DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液

dNTPPCR增強(qiáng)劑

PCRMasterMix第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日PCR

MasterMix特點(diǎn)

快速簡便減少加樣誤差和污染

靈敏度高

可擴(kuò)增低至2個(gè)拷貝的目的模板

特異性強(qiáng)降低PCR反應(yīng)的要求，增強(qiáng)特異性

穩(wěn)定性好長期放置活性無改變適用范圍

大規(guī)?；驒z測目的基因拷貝數(shù)極低的樣本

GC含量高,有二級結(jié)構(gòu)的模板復(fù)雜基因組樣本可直接檢測菌落，基因點(diǎn)突變檢測,

或者陽性克隆的篩選。第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日產(chǎn)品名稱廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

PCRMasterMix

PlatiunitsmqPCRSunitsperMix-unitsDGInvitrogen11743-100

2,250ForABI7000,7300,7700,7900(HT)2×PCRMasterMixMBIR01715ml87510050unitslrxns2×HostStartMasterMixMBIR02115ml1,0502XPCRMasterMixfor25020-unitslrxns;generates3'dAprodunitsctsunitspto4kbTaq2×MasterMixNEBM0270S8ml720400unitsTaq;Stableat4degreefor3monthsNEBM0270L5×8ml2,8802000unitsTaq;genomicDNA:4KbTaqPCRKitNEBE5000S200rxn1,200TaqDNApolymerase,dNTPs,DNAmarkerTaqPCRMasterMixQiagen2014433×1.7ml1,950250unitsTaqReadyMixTaqPCRReactionMixSigmaP4600-20RXN20rxn360WithMgCl2SigmaP4600-100RXN100rxn1,200

RedTaqReadyMixPCRReactionMixSigmaR2523-20RXN20rxn390Reddyeindicatesenzymeaddition&mixing;directloadingongel;highthrounitsgghpunitstapplicationsSigmaR2523-100RXN100rxn1,200Easy-AHighFidelityPCRmasterMixStratagene600640100rxn3,900

PfunitsunitsltraHotstartPCRMasterMixStratagene600630100rxn4,500VizarsSVGelandPCRClean-unitspSystemPromegaA928150preps562

第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日如何選擇最合適的DNA修飾酶酶的作用第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日DNA連接酶修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子還可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作輔因子。第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日產(chǎn)品名稱廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

DNA連接酶T4DNA連接酶Invitrogen15224-017100unitsnits610

Invitrogen15224-025500單位2,090Invitrogen15224-041250單位1,210T4DNALigase"HICONC."Invitrogen15224-0904×500單位6,740MBIEL0015200units158

NEBM0202V10,000unitsnits335400,000unitsnits/mlNEBM0202S20000unitsnits756

NEBM0202L100,000unitsnits3,024NEBM0202M20000units756Highconcentrationat2,000,000unitsnits/mlNEBM0202T100,000units3,024PromegaM1794500units1,248

PromegaM1801100units312PromegaM1804500units1,209

TakaraD2011A25,000units120第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日E.coliDNAligase作用于5’端帶磷酸基團(tuán)的DNA底物NAD+可促進(jìn)該催化反應(yīng)分子克隆使用不多，亦不能連接RNA。用途:cDNA第二鏈合成。第三十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日產(chǎn)品名稱廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

DNA連接酶E.coliDNA連接酶Invitrogen18052-019100unitsnits420

NEBM0205V100unitsnits280NEBM0205S200unitsnits636

NEBM0205L1,000unitsnits2,544TakaraD2160A1,000unitsnits150

第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日T4RNAligase催化單鏈DNA或RNA連接。主要用途是對RNA進(jìn)行3＇末端標(biāo)記第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日產(chǎn)品名稱廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

RNA連接酶T4RNA連接酶MBIEL00211000units398NEBM0204S1000unitsnits636

NEBM0204L5000unitsnits2,544

PromegaM1051500units819TakaraD2050200units120

第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日以核酸為底物的水解酶按底物專一性分：RNase、DNase、非專一性核酸酶按作用位點(diǎn)分：內(nèi)切或外切酶

5‘-核酸酶或3’-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、綠豆核酸酶、RNaseARNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌體外切核酸酶等。許多核酸酶兼有內(nèi)切和外切活性核酸酶第三十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日產(chǎn)品名稱廠商及貨號(hào)規(guī)格價(jià)格￥應(yīng)用范圍與產(chǎn)品特性

核酸酶脫氧核