酶催化反應動力學固定化酶演示文稿

酶催化反應動力學固定化酶演示文稿第一頁，共一百二十九頁。酶催化反應動力學固定化酶第二頁，共一百二十九頁。酶催化反應動力學也稱酶促反應動力學（kineticsofenzyme-catalyzedreactions），是研究酶促反應速度以及影響此速度的各種因素的科學。在研究酶的結構與功能的關系以及酶的作用機制時，需要酶促反應動力學提供相關的實驗證據；為了找到最有利的反應條件從而提高酶催化反應的效率以及了解酶在代謝過程中的作用和某些藥物的作用機制等，也需要我們掌握酶促反應動力學的相關規(guī)律。因此，對于酶促反應動力學的研究既有重要的理論意義又具有相當的實踐價值。第三頁，共一百二十九頁。酶促反應動力學以化學動力學為基礎，通過對酶促反應速度的測定來討論諸如底物濃度、抑制劑、溫度、pH和激活劑等因素對酶促反應速度的影響。酶的動力學研究包括哪些內容?重要第四頁，共一百二十九頁。溫度、pH及激活劑都會對酶促反應速度產生十分重要的影響，酶促反應不但需要最適溫度和最適pH，還要選擇合適的激活劑。而且在研究酶促反應速度以及測定酶的活力時，都應選擇相關酶的最適反應條件。第五頁，共一百二十九頁。3.1酶催化反應速度如果我們以產物生成量(或底物減少量)來對反應時間作圖，便可以得到如圖3-1所示的曲線圖。第六頁，共一百二十九頁。圖3-1酶促反應的速度曲線該曲線的斜率表示單位時間內產物生成量的變化，因此曲線上任何一點的斜率就是相應橫坐標上時間點的反應速度。從圖中的曲線可以看出在反應開始的一段時間內斜率幾乎不變，然而隨著反應時間的延長，曲線逐漸變平坦，相應的斜率也漸漸減小，反應速度逐漸降低，顯然這時測得的反應速度不能代表真實的酶活力。第七頁，共一百二十九頁。引起酶促反應速度隨反應時間延長而降低的原因很多，如底物濃度的降低、產物濃度增加從而加速了逆反應的進行、產物對酶的抑制或激活作用以及隨著反應時間的延長引起酶本身部分分子失活等等。因此在測定酶活力時，應測定酶促反應的初速度，從而避免上述各種復雜因素對反應速度的影響。由于反應初速度與酶量呈線性關系，因此可以用測定反應初速度的方法來測定相關制劑中酶的含量。第八頁，共一百二十九頁。酶活力測定時需注意：1選擇反應的最適溫度，根據不同的底物和緩沖液選擇反應的最適pH。2速度要快，取反應的初速度3底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反應待測酶的活力第九頁，共一百二十九頁。測定酶活力的基本原理酶蛋白的含量很低，很難直接測定其蛋白質的含量，且常與其他各種蛋白質混合存在，將其提純耗時費力。故不能直接用重量或體積等指標來衡量。測定產物增加量測定底物減少量第十頁，共一百二十九頁。測定酶活力常用的方法：分光光度法（spectrophotometry）利用底物和產物再紫外或可見光部分的光吸收的不同，選擇某一適當的波長，測定反應過程中反應進行的情況熒光法（fluorometry）根據酶促反應的底物或產物的熒光性質的差別來進行酶活力的測定同位素法（isotopemethod）放射性同位素的底物在經酶作用后所得到的產物，通過適當的方法進行分離，從而只需測定產物的脈沖數即可換算出酶的活力單位電化學方法（electrochemicalmethod）其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等第十一頁，共一百二十九頁。3.2底物濃度對酶促反應速度的影響中間絡合物學說中間絡合物學說也稱酶底物中間絡合物學說，最早是由Henri和Wurtz兩位科學家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實驗研究化學反應中底物濃度與反應速度的關系時發(fā)現，當酶濃度不變時，可以測出一系列不同底物濃度下的化學反應速度，以該反應速度對底物濃度作圖，可得到如圖3-2所示的曲線。

第十二頁，共一百二十九頁。圖3-2底物濃度對酶促反應速度的影響第十三頁，共一百二十九頁。從該曲線圖可以看出，當底物濃度較低時，反應速度與底物濃度的關系呈正比關系，反應表現為一級反應。然而隨著底物濃度的不斷增加，反應速度不再按正比升高，此時反應表現為混合級反應。當底物濃度達到相當高時，底物濃度對反應速度影響逐漸變小，最后反應速度幾乎與底物濃度無關，這時反應達到最大反應速度（Vmax），反應表現為零級反應。第十四頁，共一百二十九頁。根據這一實驗結果，Henri和Wurtz提出了酶促化學反應的酶底物中間絡合物學說。該學說認為：當酶催化某一化學反應時，酶(E)首先需要和底物(S)結合生成酶底物中間絡合物即中間復合物(ES)，然后再生成產物(P)，同時釋放出酶。該學說可以用下面的化學反應方程式來表示：

S+EES→P+E第十五頁，共一百二十九頁。我們根據中間絡合物學說很容易解釋圖3-2所示的實驗曲線，在酶濃度恒定這一前提條件下，當底物濃度很小時酶還未被底物所飽和，這時反應速度取決于底物濃度并與之成正比。隨著底物濃度不斷增大，根據質量作用定律，中間復合物ES生成也不斷增多，而反應速度取決于ES的濃度，故反應速度也隨之增高但此時二者不再成正比關系。第十六頁，共一百二十九頁。當底物濃度達到相當高的程度時，溶液中的酶已經全部被底物所飽和，此時溶液中再也沒有多余的酶，雖增加底物濃度也不會有更多的中間復合物ES生成，因此酶促反應速度變得與底物濃度無關，而且反應達到最大反應速度（Vmax）。當我們以底物濃度[S]對反應速度v作圖時，就形成一條雙曲線。在此需要特別指出的是，只有酶促催化反應才會有這種飽和現象，而與此相反，非催化反應則不會出現這種飽和現象。第十七頁，共一百二十九頁。酶促反應的動力學方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten兩位科學家在前人工作的基礎上，根據酶促反應的中間絡合物學說，推導出一個數學方程式，用來表示底物濃度與酶反應速度之間的量化關系，通常把這個數學方程式稱為米氏方程：其中Km稱為米氏常數第十八頁，共一百二十九頁。米氏常數的含義Km值就代表著反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度。第十九頁，共一百二十九頁。米氏常數的應用價值Km是酶的一個特征性常數：也就是說Km的大小只與酶本身的性質有關，而與酶濃度無關。Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結合緊密程度的—個度量指標，用來表示酶與底物結合的親和力大小。已知某個酶的Km值，就可以計算出在某一底物濃度條件下，其反應速度相當于Vmax的百分比。

Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應才會在競爭中占優(yōu)勢。第二十頁，共一百二十九頁。3.3抑制劑對酶促反應速度的影響由于酶的本質是蛋白質，凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用都稱為失活作用(inactivation)。如果由于酶必需基團的化學性質發(fā)生改變，但酶并未發(fā)生變性，而引起酶活力降低或喪失的作用則稱為抑制作用(inhibition)。導致酶發(fā)生抑制作用的物質稱為抑制劑(inhibitor)。第二十一頁，共一百二十九頁。由于抑制作用與變性作用從本質而言是不同的，因此與變性劑對酶的變性作用無選擇性不同的是，抑制劑對酶的抑制作用是有選擇性的，即一種抑制劑只能使某一種酶或對某一類酶產生抑制作用。第二十二頁，共一百二十九頁。對酶抑制作用的探討是研究酶的結構與功能、酶的催化機制以及闡明機體代謝途徑的基本手段，也可以為醫(yī)藥產業(yè)中設計新藥物和農業(yè)生產中設計新農藥提供重要的理論依據，從這個角度而言，對酶抑制作用的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有突出的實踐價值。第二十三頁，共一百二十九頁。抑制作用的類型根據抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆，我們可以將抑制作用分為兩大類，即：不可逆的抑制作用可逆的抑制作用。第二十四頁，共一百二十九頁。3.3.1.1不可逆的抑制作用由于抑制劑與酶的必需基團以共價鍵的形式結合而引起酶活力降低或喪失，因此不能用透析、超濾等物理方法去除抑制劑而使酶復活，這種抑制作用是不可逆的，我們稱之為不可逆抑制。此時被抑制的酶分子受到抑制劑對其不同程度的化學修飾，因此不可逆抑制從本質上來說就是酶的修飾抑制。第二十五頁，共一百二十九頁。不可逆抑制劑通常把不可逆抑制劑分為兩種類型，即非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。第二十六頁，共一百二十九頁。①非專一性不可逆抑制劑主要包括以下六大類：a) 有機磷化合物b) 有機汞、有機砷化合物：抑制含巰基的酶。c) 重金屬鹽：能使酶蛋白變性而失活。d) 烷化劑：與酶必需基團中的巰基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等結合，從而抑制酶活性。e) 硫化物、氰化物和CO：這類物質能通過與酶中金屬離子形成較為穩(wěn)定絡合物的形式，來抑制酶的活性。f) 青霉素（Penicillin）：青霉素可通過與糖肽轉肽酶活性部位絲氨酸羥基共價結合的方式，使糖肽轉肽酶失活，導致細菌細胞壁合成受阻，從而損害細菌生長。第二十七頁，共一百二十九頁。②專一性不可逆抑制劑可以分為Ks型和Kat型兩大類。a) Ks型不可逆抑制劑：具有與底物相類似的結構b) Kat型不可逆抑制劑：該類抑制劑不但具有與天然底物相類似的結構，而且抑制劑本身也是酶的底物，這類不可逆抑制劑的特點是專一性極高，因此也被稱為自殺性底物（suicidesubstrate）。第二十八頁，共一百二十九頁。3.3.1.2可逆的抑制作用由于抑制劑與酶以非共價鍵的形式結合而引起酶活力降低或喪失，但是能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活，這種抑制作用是可逆的，我們稱之為可逆抑制(reversibleinhibition)。第二十九頁，共一百二十九頁。根據可逆抑制劑與底物的關系，我們將可逆抑制作用分為三種類型，它們分別是競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。第三十頁，共一百二十九頁。①競爭性抑制(competitiveinhibition)：是最常見的一種可逆抑制作用。抑制劑(I)與底物(S)競爭酶(E)的同一結合部位，因此抑制劑的存在直接影響底物與酶的正常結合。這是由于酶的活性部位不能同時既與底物結合又與抑制劑結合，所以在底物和抑制劑之間會產生競爭，從而形成一定的平衡關系。第三十一頁，共一百二十九頁。對于絕大多數競爭性抑制劑而言，其結構與底物結構十分類似，因此也能與酶的活性部位結合形成可逆的酶-抑制劑復合物EI，但酶-抑制劑復合物EI不能分解成產物P，導致相應的酶促反應速度下降。其抑制程度取決于底物和抑制劑的相對濃度，可以通過增加底物濃度的方法來解除這種抑制作用。這類抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸競爭與琥珀酸脫氫酶結合，但不能催化脫氫反應。第三十二頁，共一百二十九頁。②非競爭性抑制(noncompetitiveinhibition)：這類抑制作用的特點是底物(S)和抑制劑(I)可以同時與酶(E)結合，兩者之間不存在競爭關系。但是在酶與抑制劑結合后，還可以進一步與底物結合形成酶-底物-抑制劑復合物ESI；酶與底物結合后，也可以進一步與抑制劑結合形成酶-底物-抑制劑復合物ESI。但是這種中間的三元復合物，即酶-底物-抑制劑復合物ESI不能進一步分解產生產物，因此相應的酶促反應速度下降。第三十三頁，共一百二十九頁。由于這類抑制劑與酶活性部位以外的基團相結合，因此其結構與底物結構并無相似之處，而且不能用增加底物濃度的方法來解除這種抑制作用，故稱非競爭性抑制。這類抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一種非競爭性抑制劑。還有某些重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等對酶的抑制作用也屬于這一類。第三十四頁，共一百二十九頁。③反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)：這類抑制作用的特點是只有在酶(E)與底物(S)結合后，才能與抑制劑(I)結合，形成酶-底物-抑制劑復合物ESI，與非競爭性抑制相似，這種中間的三元復合物，即酶-底物-抑制劑復合物ESI不能進一步分解產生產物，因此相應的酶促反應速度下降。第三十五頁，共一百二十九頁。這種抑制作用在單底物反應中比較少見，而常見于多底物反應中。目前已經證明，肼類化合物對胃蛋白酶的抑制作用、氰化物對芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多種氨基酸對堿性磷酸酶的抑制作用都屬于反競爭性抑制。第三十六頁，共一百二十九頁。圖3-3酶與底物或抑制劑結合的中間物第三十七頁，共一百二十九頁。第三十八頁，共一百二十九頁?？赡嬉种谱饔煤筒豢赡嬉种谱饔玫蔫b別鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用，除了用透析、超濾和凝膠過濾等物理方法能否除去抑制劑來判斷外，還可采用化學動力學的方法來區(qū)分。第三十九頁，共一百二十九頁。圖3-4可逆抑制劑與不可逆抑制劑的區(qū)別（一）曲線1，無抑制劑；曲線2，不可逆抑制劑；曲線3，可逆抑制劑第四十頁，共一百二十九頁。在測定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，然后測定不同酶濃度條件下的酶促反應初速度，以酶促反應初速度對酶濃度作圖。在測定酶活力的系統(tǒng)中不加抑制劑時，以酶促反應初速度對酶濃度作圖得到如圖3-4曲線1所示的一條通過原點的直線；當測定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的不可逆抑制劑時，由于抑制劑會使一定量的酶失活，因此只有加入的酶量大于不可逆抑制劑的量時，才表現出酶活力。第四十一頁，共一百二十九頁。以酶促反應初速度對酶濃度作圖得到如圖3-4曲線2所示的一條與曲線1平行的相交于橫坐標正側的直線，所以不可逆抑制劑的作用相當于把原點向右移動；當測定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的可逆抑制劑時，由于抑制劑的量是恒定的，因此以酶促反應初速度對酶濃度作圖得到如圖3-4曲線3所示的一條通過原點，但斜率較低于曲線1的直線。第四十二頁，共一百二十九頁?？赡嬉种谱饔脛恿W對于可逆抑制劑與酶結合后產生的抑制作用，可以根據米氏學說基本原理加以推導，來定量說明可逆抑制劑對酶促反應速度的影響，下面著重討論三種類型可逆抑制作用的化學動力學。第四十三頁，共一百二十九頁。3.3.3.1競爭性抑制在競爭性抑制中，底物(S)或抑制劑(I)與酶(E)的結合都是可逆的，因此存在著如下的化學平衡式：第四十四頁，共一百二十九頁。在加入競爭性抑制劑后，Vmax不變，Km變大，Km’﹥Km，而且Km隨抑制劑濃度[I]的增加而增加。抑制分數與抑制劑濃度[I]成正比，而與成反應物濃度[S]反比。雙倒數作圖所得直線相交于縱軸，這就是競爭性抑制作用的特點。第四十五頁，共一百二十九頁。圖3-5競爭性抑制曲線第四十六頁，共一百二十九頁。3.3.3.2非競爭性抑制在非競爭性抑制中，抑制劑(I)與酶(E)或酶-底物復合物(ES)以及底物(S)與酶-抑制劑復合物(EI)的結合都是可逆的，因此存在著如下的化學平衡式：第四十七頁，共一百二十九頁。在加入非競爭性抑制劑后，Km值不變，Vmax變小，而且Km’=Km，Vmax隨[I]的增加而減小。抑制分數與抑制劑濃度[I]成正比，而與底物濃度[S]無關，即[I]不變時，任何[S]的抑制分數是一個常數。雙倒數作圖所得直線相交于橫軸，這是非競爭性抑制作用的特點。第四十八頁，共一百二十九頁。圖3-6非競爭性抑制曲線第四十九頁，共一百二十九頁。3.3.3.3反競爭性抑制反競爭性抑制的特點是，酶(E)必須先與底物(S)結合，然后才與抑制劑(I)結合，即抑制劑(I)與酶-底物復合物(ES)的結合是可逆的，因此存在著如下的化學平衡式：第五十頁，共一百二十九頁。在加入反競爭性抑制劑后，Km及Vmax都變小，而且Km’﹤Km，Vmax’﹤Vmax，即表觀Km及表觀Vmax，都隨[I]的增加而減小。抑制分數既與抑制劑濃度[I]成正比，也與底物濃度[S]成正比。雙倒數作圖為一組平行線，這是反競爭性抑制作用的特點。第五十一頁，共一百二十九頁。圖3-7反競爭性抑制曲線第五十二頁，共一百二十九頁。為了方便理解和記憶，我們現將無抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結歸納在表3-1中。第五十三頁，共一百二十九頁。為了便于比較三種抑制類型的區(qū)別，我們可以用Dixon作圖法求Ki，只要以抑制劑濃度[I]為橫坐標，以酶促反應速度的倒數1/v為縱坐標，采用一個以上的底物濃度[S]，然后給出不同[S]時的直線，再由這些直線的交點即可以得到Ki，如圖3-8所示。第五十四頁，共一百二十九頁。圖3-8Dixon作圖法求Ki（[S2]﹥[S1]）A.非競爭性抑制B.競爭性抑制C.反競爭性抑制第五十五頁，共一百二十九頁。3.4其它因素對酶促反應速度的影響其它各種影響酶促反應速度的因素主要包括溫度、pH和激活劑等。第五十六頁，共一百二十九頁。溫度對酶促反應速度的影響和絕大多數化學反應一樣，酶促化學反應速度也和溫度密切相關。溫度對酶促化學反應速度的影響主要表現在兩個方面，其一是當溫度升高時，與一般化學反應一樣，反應速度加快，這種影響可以用反應的溫度系數來衡量。第五十七頁，共一百二十九頁。所謂反應的溫度系數是指反應溫度提高10℃，其反應速度與原來反應速度之比，通常用Q10來表示。對大多數酶而言，酶促化學反應的溫度系數Q10多為2，即溫度每升高10℃，酶促化學反應速度為原反應速度的2倍。其二是由于酶的本質是蛋白質，因此隨著溫度逐漸升高，酶蛋白會因逐漸變性而失活從而導致酶促化學反應速度下降。第五十八頁，共一百二十九頁。在不同溫度條件下進行某種酶促化學反應，然后將所測得的酶促反應速度相對于溫度來作圖，即可得到如圖3-9所示的鐘罩形曲線。從該曲線我們可以看出，在較低的溫度范圍內，酶促化學反應速度隨溫度升高而增大，但在超過一定溫度后，酶促化學反應速度不見上升反而下降，因此只有在某一溫度條件下，酶促化學反應速度達到最大值，通常把這個溫度稱為酶促化學反應的最適溫度(optimumtemperature)。在一定條件下每種酶都有其催化反應的最適溫度。第五十九頁，共一百二十九頁。酶所表現的最適溫度是上述兩種影響綜合作用的結果。在酶促化學反應的最初階段，酶蛋白的變性尚未表現出來，第一個方面的影響占主導地位，因此反應速度隨溫度升高而增加；但當反應溫度逐漸高于最適溫度時，酶蛋白變性逐漸突出，第二個方面的影響逐漸取代第一個方面的影響從而占主導地位，反應速度隨溫度升高的效應也將逐漸被酶蛋白變性效應所抵消，反應速度開始迅速下降，因此表現出酶促化學反應的最適溫度。第六十頁，共一百二十九頁。一般來說，動物細胞內的酶最適溫度一般為35～40℃，植物細胞中的酶最適溫度較動物細胞中稍高，通常在40～50℃之間，而微生物中的酶最適溫度差別則較大，如用于進行PCR反應的TaqDNA聚合酶的最適溫度可高達70℃。第六十一頁，共一百二十九頁。需要指出的是，最適溫度不是酶的特征物理常數，相反它常常受到其他各種條件如底物種類、作用時間、pH和離子強度等因素影響。如最適溫度隨酶促反應進行時間的長短而改變，這是因為溫度使酶蛋白發(fā)生變性效應是隨時間而逐步累加的。一般而言，酶促反應進行時間長時酶的最適溫度低，酶促反應進行時間短則最適溫度高，所以只有在規(guī)定的酶促反應時間內才可確定酶的最適溫度。第六十二頁，共一百二十九頁。圖3-9溫度對酶促反應速度的影響

酶在固體狀態(tài)下比在溶液中對溫度的耐受力更高。酶的冰凍干粉制劑通常在冰箱中可存放幾個月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存數周。所以酶制劑以固體保存為佳。第六十三頁，共一百二十九頁。4.5.2pH對酶促反應速度的影響除溫度影響之外，酶的活力還受到環(huán)境pH的影響。通常在一定pH下，酶會表現出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就會降低，我們把表現出酶最大活力時的pH稱為該酶的最適pH，在不同pH條件下進行某種酶促化學反應，然后將所測得的酶促反應速度相對于pH來作圖，即可得到如圖3-10所示的鐘罩形曲線。第六十四頁，共一百二十九頁。圖3-10pH對酶活力的影響第六十五頁，共一百二十九頁。與酶促化學反應的最適溫度不同的是，各種酶在一定條件下都有其特定的最適pH，因此最適pH是酶的特性之一。但是酶的最適pH并不是一個常數，它受諸如底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等眾多因素的影響，因此只有在一定條件下最適pH才有意義。第六十六頁，共一百二十九頁。絕大多數酶的最適pH在5～8之間，動物體內的酶最適pH多在6.5～8.0之間，植物及微生物中的酶酶最適pH多在4.5～6.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最適pH為1.5，肝中精氨酸酶最適pH為9.7等等。第六十七頁，共一百二十九頁。pH影響酶活力的原因可能包括以下幾個方面：(1)過酸或過堿使酶的空間結構遭到破壞，引起酶變性從而導致酶構象的改變、酶活性隨之喪失。(2)當pH改變不是十分劇烈時，酶雖未發(fā)生變性，但其活力已經受到影響。這是由于pH影響了底物的解離狀態(tài)或酶分子活性部位上有關基團的解離狀態(tài)或酶-底物復合物的解離狀態(tài)，而使底物不能與酶結合形成酶-底物復合物，或者形成酶-底物復合物后不能生成產物，使酶活性降低。第六十八頁，共一百二十九頁。(3)pH影響了與維持酶分子空間結構有關的基團解離，從而改變酶活性部位的構象，進而降低了酶的活性。第六十九頁，共一百二十九頁。4種pH-酶活性曲線第七十頁，共一百二十九頁。激活劑對酶促反應速度的影響與抑制劑相對的是，凡是能提高酶活性的物質都稱為激活劑(activator)，而激活劑中大部分是無機離子或簡單的有機化合物。作為激活劑的金屬離子主要包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+等離子，無機陰離子主要包括Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-等。如Mg2+可以作為多種激酶及合成酶的激活劑，Cl-可以作為唾液淀粉酶的激活劑。第七十一頁，共一百二十九頁。激活劑對酶的作用具有一定程度的選擇性，即一種激活劑只對某種酶起激活作用，而對另一種酶可能不起任何作用或起抑制作用，如對脫羧酶而言有激活作用的Mg2+對肌球蛋白腺三磷酶卻有抑制作用；而對脫羧酶而言有抑制作用的Ca2+對肌球蛋白腺三磷酶卻有激活作用。有時各種離子之間有拮抗作用，如被K+激活的酶會受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶會受Ca2+的抑制。有時金屬離子的作用也可以相互替代，如作為激酶的激活劑的Mg2+可被Mn2+所代替。第七十二頁，共一百二十九頁。除此以外，可因濃度不同，同一種激活劑對于同一種酶會起不同的作用，如對于NADP+合成酶，當Mg2+濃度為(5～10)×10-3mol／L時起激活作用酶活性上升，但當濃度升高到30×10-3mol／L時酶活性下降；如果用Mn2+代替Mg2+，則在1×10-3mol／L起激活作用酶活性上升，高于此濃度時則起抑制作用酶活性下降。第七十三頁，共一百二十九頁。除了上面提到的金屬離子之外，有些小分子有機化合物也可作為酶的激活劑。例如對木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶等含巰基的酶而言半胱氨酸，還原型谷胱甘肽等還原劑對其有激活作用，它們可使酶中二硫鍵還原成巰基從而提高酶活性。因此在分離純化木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶等含巰基的酶過程中，往往需加半胱氨酸，還原型谷胱甘肽等還原劑，以保護巰基不至于在分離純化過程中被氧化。第七十四頁，共一百二十九頁。第4章固定化酶和固定化細胞（2學時）主要內容：

4.1固定化酶的定義與優(yōu)點

4.2酶固定化技術發(fā)展史

4.3固定化酶的制備方法

4.4固定化酶的特性

4.5固定化活細胞

4.6酶催化反應器及其類型第七十五頁，共一百二十九頁。本章主要介紹了固定化技術的發(fā)展史、酶和細胞的固定化方法以及酶經固定化后性質的變化，從動力學方面分析了固定化后酶特性變化的原因，并簡要介紹了酶反應器的結構特點。第七十六頁，共一百二十九頁。固定化酶、固定化細胞是一種在空間運動上受到完全約束或局部約束的酶、細胞。近代工業(yè)化利用始于1969年固定化氨基?；傅膽谩＠霉潭ɑ夹g，解決了酶應用過程中的很多問題，為酶的應用開辟了新的前景。如可使所使用的酶、細胞能反復使用，使產物分離提取容易，并在生產工藝上可以實現連續(xù)化和自動化，故在20世紀70年代后得到迅速發(fā)展。其新的功能和新的應用正在迅速不斷地擴展，是一項研究領域寬廣、應用前景極為引人矚目的新研究領域和新技術。第七十七頁，共一百二十九頁。4.1固定化酶的定義與優(yōu)點所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間范圍內起催化作用，并能反復和連續(xù)使用的酶。第七十八頁，共一百二十九頁。固定化酶的優(yōu)點：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復多次地使用；（2）固定化后，和反應物分開，有利于控制生產過程，同時也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長期使用，并可預測衰變的速度；（5）提供了研究酶動力學的良好模型。第七十九頁，共一百二十九頁。4.2酶固定化技術發(fā)展史

酶作為一種生物催化劑，因其催化作用具有高度專一性、催化條件溫和、無污染等特點，廣泛應用于食品加工、醫(yī)藥和精細化工等行業(yè)。但在使用過程中，人們也注意到酶的一些不足之處，如酶穩(wěn)定性差、不能重復使用，并且反應后混入產品，純化困難，使其難以在工業(yè)中更為廣泛的應用。為適應工業(yè)化生產的需要，人們模仿人體酶的作用方式，通過固定化技術對酶加以固定改造，來克服游離酶在使用過程中的一些缺陷。第八十頁，共一百二十九頁。將酶固定化以后，既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，使其具有一般化學催化劑能回收反復使用的優(yōu)點，并在生產工藝上可以實現連續(xù)化和自動化。事實上，早在1916年，Nelson和Griffin就用吸附的方法實現了酶的固定化，他們將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，發(fā)現吸附以后酶不溶于水而且具有和液體酶同樣的活性，可惜這個重要的發(fā)現長期以來沒有得到酶學家的重視。第八十一頁，共一百二十九頁。系統(tǒng)地進行酶的固定化研究則是從20世紀50年代開始的。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹氮脂重化，然后將淀粉酶、羧肽酶、、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶與這種載體結合，制成了固定化酶。六十年代后期，酶固定化技術迅速發(fā)展，出現了很多新的酶固定化方法。1969年，日本的著名學者千畑一郎等將固定化氨基酰化酶應用于DL-氨基酸的光學拆分上，來生產L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應用于工業(yè)生產的先例。第八十二頁，共一百二十九頁。在20世紀60年代后期對酶的固定化研究主要是將酶與水不溶性載體結合起來，成為不溶于水的酶衍生物，所以最初曾稱為水不溶酶（waterinsolubleenzyme）和固相酶（solidphaseenzyme）。但是隨著理論與技術的發(fā)展，后來發(fā)現也可以將溶解狀態(tài)的酶固定在一個有限的空間使其不能自由移動，也能達到固定酶的作用。如把酶包埋在凝膠內，酶本身是可溶的，因此，用水不溶酶和固相酶的名稱就不恰當了。所以在1971年召開的第一屆國際酶工程會議上，建議采用統(tǒng)一的英文名稱ImmobilizedEnzyme。第八十三頁，共一百二十九頁。用于固定化的酶，起初都是采用經提取和分離純化后的酶，后來隨著固定化技術的發(fā)展，作為固定化的對象已不一定是酶，也可對含酶細胞或細胞器進行固定化。1973年，日本的千畑一郎等成功的使用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產L-天冬氨酸，將固定化微生物細胞首次應用于工業(yè)生產，使細胞固定化技術迅速發(fā)展1986年，我國科學家利用固定化原生質體發(fā)酵生產堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功。第八十四頁，共一百二十九頁。目前，固定化技術已經取得了許多重要成果，充分發(fā)揮了固定化酶和固定化細胞在改革工藝和降低成本方面的巨大潛力。但從目前的發(fā)展狀況來看，盡管酶種類繁多，但已經固定化的酶卻相對有限，采用固定化酶技術大規(guī)模生產的企業(yè)尚屬少數，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數不多的十幾個酶種，故仍需大力研究開發(fā)使更多的固定化酶和細胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產。第八十五頁，共一百二十九頁。4.3固定化酶的制備方法固定化酶的制備方法、制備材料多種多樣，不同的制備方法和材料，固定化后酶的特性不同。對于特定的目標酶，要根據酶自身的性質、應用目的、應用環(huán)境來選擇固定化載體和方法。第八十六頁，共一百二十九頁。在具體選擇時，一般應遵循以下幾個原則。

（1）必須注意維持酶的構象，特別是活性中心的構象。酶的催化反應取決于酶本身蛋白質分子所特有的高級結構和活性中心，為了不損害酶的催化活性及專一性，酶在固定化狀態(tài)下發(fā)揮催化作用時，既需要保證其高級結構，又要使構成活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化。第八十七頁，共一百二十九頁。這就要求酶與載體的結合部位不應當是酶的活性部位，應避免活性中心的氨基酸殘基參與固定化反應；另外，由于酶蛋白的高級結構是憑借疏水鍵、氫鍵、鹽鍵等較弱的鍵維持的，所以固定化時應采取盡可能溫和的條件，避免那些可能導致酶蛋白高級結構破壞的條件，如高溫、強酸、強堿、有機溶劑等處理。第八十八頁，共一百二十九頁。（2）酶與載體必須有一定的結合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復使用。（3）固定化應有利于自動化、機械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機械強度，才能使之在制備過程中不易破壞或受損。（4）固定化酶應有最小的空間位阻。固定化應盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產物的量。第八十九頁，共一百二十九頁。（5）固定化酶應有最大的穩(wěn)定性。在應用過程中，所選載體應不和底物、產物或反應液發(fā)生化學反應。（6）固定化酶的成本適中。工業(yè)生產必須要考慮到固定化成本，要求固定化酶應是廉價的，以利于工業(yè)使用。第九十頁，共一百二十九頁。酶的固定化方法主要可分為四類：吸附法、包埋法、共價鍵結合法和交聯法等。吸附法和共價鍵結合法又可統(tǒng)稱為載體結合法。第九十一頁，共一百二十九頁。吸附法吸附法（adsorption）是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。第九十二頁，共一百二十九頁。物理吸附法(physicaladsorption)是通過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用過此法進行固定化。物理吸附法常用的有機載體如纖維素、膠原、淀粉及面筋等；無機載體如活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。（1）物理吸附法第九十三頁，共一百二十九頁。物理吸附法制備固定化酶，優(yōu)點：操作簡單、價廉、條件溫和，載體可反復使用，酶與載體結合后，活性部位及空間構象變化不大，故所制得的固定化酶活力較高。缺點：由于靠物理吸附作用，酶和載體結合不牢固，在使用過程中容易脫落，所以使用受到限制。常與交聯法結合使用。第九十四頁，共一百二十九頁。離子吸附法(ionadsorption)是將酶與含有離子交換基團的水不溶性載體以靜電作用力相結合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構酶、糖化酶、β-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。如最早應用于工業(yè)化生產的氨基?；?，就是使用多糖類陰離子交換劑二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝膠固定化的。此外，DEAE-纖維素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。（2）離子吸附法第九十五頁，共一百二十九頁。離子吸附法所使用的載體是某些離子交換劑。常用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、混合胺類(ECTEOLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、AmberliteIRA-93、410、900等；陽離子交換劑有羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、AmberliteCG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附劑。離子吸附法優(yōu)點：具有操作簡便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點。此外，吸附過程同時可以純化酶。第九十六頁，共一百二十九頁。包埋法包埋法（entrapment）是將酶包埋在高聚物的細微凝膠網格中或高分子半透膜內的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。第九十七頁，共一百二十九頁。（1）凝膠包埋法凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯樹脂等合成凝膠或樹脂。（2）微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內的方法。它使酶存在于類似細胞內的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。第九十八頁，共一百二十九頁。用微膠囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直徑通常為幾微米到數百微米，膠囊孔徑為幾埃至數百埃，適合于小分子為底物和產物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、過氧化氫酶等。其制造方法有界面聚合法、界面沉淀法、二級乳化法、液膜（脂質體）法等。第九十九頁，共一百二十九頁。共價鍵結合法共價鍵結合法(covalentbinding）是將酶與聚合物載體以共價鍵結合的固定化方法。酶蛋白上可供載體結合的功能基團有以下幾種：第一百頁，共一百二十九頁。（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。第一百零一頁，共一百二十九頁。其中最普遍的共價鍵結合基團是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來和酶共價偶聯的載體的功能基團有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研究中最活躍的一大類方法，但必須注意，參加共價結合的氨基酸殘基應當是酶催化活性非必需基團，如若共價結合包括了酶活性中心有關的基團，會導致酶的活力損失。第一百零二頁，共一百二十九頁。使載體活化的方法（1）重氮法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方法，是共價鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。第一百零三頁，共一百二十九頁。（2）疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應基團偶聯成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交聯葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。第一百零四頁，共一百二十九頁。（3）溴化氰法即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯，制成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。由于該法可在非常緩和的條件下與酶蛋白的氨基發(fā)生反應，近年來已成為普遍使用的固定化方法。尤其是溴化氰活化的瓊脂糖已在實驗室廣泛用于固定化酶以及親和層析的固定化吸附劑。

第一百零五頁，共一百二十九頁。（4）烷化法和芳基化法以鹵素為功能團的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應而使酶固定化。此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。第一百零六頁，共一百二十九頁。從上面介紹的四種制備方法可看出，用共價鍵結合法制備的固定化酶，酶和載體之間都是通過化學反應以共價鍵偶聯。由于共價鍵的鍵能高，酶和載體之間的結合相當牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時間的優(yōu)點。第一百零七頁，共一百二十九頁。但是采用該方法時，載體活化的難度較大，操作復雜，反應條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學反應，易引起酶蛋白空間構象變化，酶活回收率一般為30%左右，甚至酶的底物的專一性等性質也會發(fā)生變化，往往需要嚴格控制操作條件才能獲得活力較高的固定化酶。第一百零八頁，共一百二十九頁?，F在已有不少活化的商品化酶固定化載體，它們的使用不需做大量的處理工作，商品一般以干的固定相或預裝柱的形式供應，一般情況下這些固定相已經活化好，酶的固定化只要將酶在合適的pH和其它相關條件下，讓酶循環(huán)通過柱子便可完成。

第一百零九頁，共一百二十九頁。交聯法交聯法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯呈網狀結構的固定化方法。由于酶蛋白的功能團，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應，所以酶的活性中心構造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯劑濃度和縮短反應時間將有利于固定化酶活力的提高。第一百一十頁，共一百二十九頁。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯形成固定化酶。第一百一十一頁，共一百二十九頁。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點（見表4-1）。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實際應用時，常將兩種或數種固定化方法并用，以取長補短。第一百一十二頁，共一百二十九頁。第一百一十三頁，共一百二十九頁。4.4固定化酶的特性第一百一十四頁，共一百二十九頁。固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產，如裝成酶柱用于連續(xù)生產，或在反應器中進行批式攪拌反應；薄膜主要用于酶電極，應用于分析化學；酶管機械強度較大，亦宜用于工業(yè)生產。第一百一十五頁，共一百二十九頁。固定化酶的性質酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在，但是固定后酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y合于載體的狀態(tài)，其結果往往引起酶的性質的改變。為此，在固定化酶的應用過程中，必須了解固定化酶的性質與游離酶之間的差別，并對操作條件加以適當調整。由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性質也有所不同。第一百一十六頁，共一百二十九頁。酶活力固定化酶的活力在多數情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結合；②當酶與載體結合時，它的高級結構發(fā)生了變化，其構象的改變導致了酶與底物結合能力或催化底物轉化能力的改變；③酶被固定化后，雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空