第五章固相析出分離法

目標(biāo)掌握：鹽析的原理及影響因素；有機(jī)沉淀的原理、常用有機(jī)溶劑，等電點(diǎn)沉淀的機(jī)制飽和溶液和過飽和溶液的概念熟悉：鹽析的操作過程和注意事項(xiàng)；有機(jī)沉淀操作條件的控制，操作過程中應(yīng)注意事項(xiàng)結(jié)晶的一般步驟了解：其他沉淀法第五章固相析出分離法

一、概述1.定義——改變?nèi)芤簵l件使目標(biāo)產(chǎn)物或雜質(zhì)的溶解度降低而形成固體沉淀從溶液中分出的操作技術(shù)

析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶，析出物為無定形固體時(shí)稱沉淀法2.特點(diǎn)——濃縮倍數(shù)高、操作簡便、經(jīng)濟(jì)、純化倍數(shù)低3.缺點(diǎn)：針對(duì)復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)4、類型鹽析沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法高分子聚合物沉淀法金屬離子沉淀法6)結(jié)晶法一般沉析操作的過程Step1

在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑；Step2沉淀物的純化，促進(jìn)晶體生長；Step3

離心或過濾，收集沉淀物；沉析器二、鹽析沉淀法

1.定義——是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法?！稃}析法應(yīng)用最廣的是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史,除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，20％～40％飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀，43％飽和度的硫酸銨可以使DNA和rRNA沉淀鹽析原理首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)：兩性電解質(zhì)，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系蛋白質(zhì)周圍形成水化膜，保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞Electricdoublelayer鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降，原因如下：無機(jī)離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導(dǎo)致沉淀；鹽析用鹽的選擇在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂鹽析劑的選擇鹽析劑的條件鹽析作用強(qiáng)：鹽析能力—陰離子＞陽離子；高價(jià)陰離子＞低價(jià)陰離子較大溶解度生物學(xué)上是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)常用鹽析劑—(NH4)2SO4

、Na2SO4、磷酸鹽等影響鹽析的因素?zé)o機(jī)鹽的種類溶質(zhì)種類的影響：不同蛋白質(zhì)所需無機(jī)鹽不同溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高；pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近；鹽析溫度：一般在高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降鹽析用鹽的用量選擇飽和度（Saturation）的概念：以硫酸銨為例：250C時(shí)，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L定義為100%飽和度鹽析操作方式及方法操作方式固體鹽加入飽和鹽溶液加入飽和度方法分步鹽析重復(fù)鹽析反抽提法鹽析沉淀法的特點(diǎn)

沉淀?xiàng)l件溫和，不會(huì)引起生物物質(zhì)變性失活；非蛋白的雜質(zhì)夾帶沉淀很少；適用范圍廣；鹽份含量高。

突出的優(yōu)點(diǎn)是：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。有機(jī)溶劑沉淀概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚。有機(jī)溶劑的選擇介電常數(shù)要小對(duì)生物分子的變性作用小與水互溶安全、無毒、價(jià)廉、易回收等常用的有機(jī)溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；特點(diǎn)：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48 丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。沉淀不用脫鹽，固液分相容易，有機(jī)溶劑易祛除易使蛋白質(zhì)變性失活安全性差成本較高影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素溫度：大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃攪拌速度：散熱溶液pH值：有機(jī)溶劑沉淀適宜的pH值，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH值，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。原則是避免目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。離子強(qiáng)度:少量的中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效果，通常是在低鹽或低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)，0.01~0.05mol/L樣品濃度:0.5~2%，

?。喝軇┯昧看?，樣品的損失較大，回收率低，具有生物活性的樣品易產(chǎn)生稀釋變性。但共沉淀作用小

濃：節(jié)省溶劑用量，減少變性的危險(xiǎn)，共沉作用強(qiáng)，分辨率低，分離效果下降，有利于提高分離效果。金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+等電點(diǎn)沉淀原理： 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液pH值處于等電點(diǎn)時(shí)，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結(jié)構(gòu)被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進(jìn)而產(chǎn)生沉淀。概念：

利用兩性生物物質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小而析出固相物的過程特點(diǎn)1.沉淀?xiàng)l件溫和；2.不引入新的物質(zhì)；3.沉淀效果差。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物成鹽類復(fù)合物沉析劑此類沉析劑有以下三種：（1）高價(jià)金屬鹽：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+ 與酸性基團(tuán)結(jié)合；（2）苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質(zhì)等，與堿性基 團(tuán)結(jié)合（3）無機(jī)復(fù)合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等缺點(diǎn)：容易導(dǎo)致活性蛋白的不可逆變性特點(diǎn)沉淀效果很好；容易使生物分子變性復(fù)合物難分解高分子聚合物沉淀法定義—利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的過程有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。應(yīng)用最多的是聚乙二醇（PEG)，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。

特點(diǎn)沉淀效果較好，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子，條件溫和高聚物的殘留有一定的毒性（陽離子）沉淀機(jī)理①沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強(qiáng)的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀析出。

離子型表面活性劑十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物（CTAB） 主要用于沉淀酸性多糖十二烷基磺酸鈉（SDS） 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白結(jié)晶的概念溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)成分均一，具有各種對(duì)稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列固體有結(jié)晶和無定形兩種狀態(tài)結(jié)晶析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)間進(jìn)行排列，粒子排列有規(guī)則無定形固體析出速度快，粒子排列無規(guī)則結(jié)晶操作的特點(diǎn)只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。結(jié)晶過程具有成本低、設(shè)備簡單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。結(jié)晶過程分析——幾個(gè)概念飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時(shí)，該溶液稱為飽和溶液；過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時(shí)，該溶液稱之為過飽和溶液；溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出；結(jié)晶過程的實(shí)質(zhì)結(jié)晶是指溶質(zhì)自動(dòng)從過飽和溶液中析出，形成新相的過程這一過程包括：溶質(zhì)分子凝聚成固體分子有規(guī)律地排列在一定晶格中這一過程與表面分子化學(xué)鍵力變化有關(guān)；因此，結(jié)晶過程是一個(gè)表面化學(xué)反應(yīng)過程。結(jié)晶的步驟過飽和溶液的形成晶核的形成晶體生長其中，溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過飽和度是結(jié)晶的推動(dòng)力。過飽和溶液的形成

蒸發(fā)法溫度誘導(dǎo)法鹽析法這是生化制藥中應(yīng)用最多的結(jié)晶方法。其作用是通過向結(jié)晶溶液中引入中性鹽，逐漸降低溶質(zhì)的溶解度使其過飽和，經(jīng)過一定時(shí)間后晶體形成并逐漸長大。4.透析法5.有機(jī)溶劑結(jié)晶法6.等電點(diǎn)法7.微量擴(kuò)散法8.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法

9.共沸蒸餾結(jié)晶提高晶體質(zhì)量的方法晶體質(zhì)量包括三個(gè)方面的內(nèi)容： 晶體大小、形狀和純度影響晶體大小的因素： 過飽和度、溫度、晶核質(zhì)量、攪拌等影響晶體形狀的因素： 改變過飽和度、改變?nèi)軇w系、雜質(zhì)影響晶體純度的因素：母液中的雜質(zhì)、結(jié)晶速度、晶體粒度及粒度分布晶體結(jié)塊晶體結(jié)塊是一種導(dǎo)致結(jié)晶產(chǎn)品品質(zhì)劣化的現(xiàn)象，導(dǎo)致晶體結(jié)塊的主要原因有：結(jié)晶理論：由于某些原因造成晶體表面溶解并重結(jié)晶，使晶粒之間在接觸點(diǎn)上形成固體晶橋，呈現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象；毛細(xì)管吸附理論：由于晶體間或晶體內(nèi)的毛細(xì)管結(jié)構(gòu)，水分在晶體內(nèi)擴(kuò)散，導(dǎo)致部分晶體的溶解和移動(dòng)，為晶粒間晶橋的形成提供飽和溶液，導(dǎo)致晶體結(jié)塊。重結(jié)晶經(jīng)過一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會(huì)含有一定量的雜質(zhì)。此時(shí)