組合靶基因傳感器芯片及自動(dòng)檢測(cè)儀

組合靶基因傳感器芯片

及自動(dòng)檢測(cè)儀負(fù)責(zé)人：府偉靈負(fù)責(zé)單位：西南醫(yī)院檢驗(yàn)科將壓電傳感器技術(shù)與基因芯片技術(shù)相結(jié)合適合臨床基因檢測(cè)的組合靶基因傳感器陣列及其自動(dòng)檢測(cè)儀一研究?jī)?nèi)容與目標(biāo)21.應(yīng)用疾病診斷基因突變檢測(cè)環(huán)境監(jiān)測(cè)32.儀器特點(diǎn)價(jià)格低廉、便于攜帶使用方便、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)無(wú)需標(biāo)記、可長(zhǎng)期保存檢驗(yàn)靈敏度高可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)本或同一標(biāo)本多個(gè)基因4微型壓電傳感器陣列芯片的研制壓電諧振陣列自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)基因傳感器芯片及封裝、進(jìn)樣系統(tǒng)基因檢測(cè)儀及應(yīng)用軟件特異性探針的設(shè)計(jì)和合成各種疾病標(biāo)本的收集、保存與處理確定相應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)比實(shí)驗(yàn)二已完成的研究工作5一.雜交反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等研究離子強(qiáng)度對(duì)雜交效應(yīng)的影響溫度對(duì)雜交效應(yīng)的影響探針濃度對(duì)雜交效應(yīng)的影響靶序列濃度對(duì)雜交效應(yīng)的影響堿基不匹配對(duì)雜交效應(yīng)的影響不同結(jié)合位點(diǎn)對(duì)雜交效應(yīng)的影響不同探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效應(yīng)的影響靶序列長(zhǎng)度對(duì)雜交效應(yīng)的影響金、銀膜作傳感器電極時(shí)檢測(cè)對(duì)比掃描隧道顯微鏡觀察61.離子強(qiáng)度對(duì)雜交效應(yīng)的影響頻率變化值隨離子強(qiáng)度增加而增加石英晶體的振蕩性能受溶液電解質(zhì)濃度的影響緩沖液NaCl濃度以0.2M較為適宜72.溫度對(duì)雜交效應(yīng)的影響隨溫度增加，雜交時(shí)間有縮短趨勢(shì)，雜交前后的頻率差值逐漸減小隨溫度增加，靶序列與探針之間的離解率常數(shù)明顯升高。83.探針濃度對(duì)雜交效應(yīng)的影響雜交效率與探針的初始濃度有關(guān)。探針濃度增加，雜交所致頻率變化值增大，但濃度過(guò)高時(shí)(1.0、3.5uM)，頻率變化值反而有所下降。其原因可能主要與探針的空間排列結(jié)構(gòu)和DNA分子間的靜電排斥有關(guān)。94.靶序列濃度對(duì)雜交效應(yīng)的影響靶序列濃度增加（從0.005uM到3.5uM），雜交所致頻率差值逐漸增大，Δf與[target]0呈一飽和曲線關(guān)系。靶序列濃度為0.001uM、0.0001uM時(shí)，傳感器未能檢測(cè)出頻率變化，此為靈敏度受限所致。提高靈敏度有多種方法，但在實(shí)際應(yīng)用中的可行性還需進(jìn)一步探討。105.堿基不匹配對(duì)雜交效應(yīng)的影響不匹配堿基數(shù)增加，靶序列與探針之間的結(jié)合率明顯降低，而其離解率明顯增高，表明堿基不匹配使DNA雙鏈之間結(jié)合力減弱，更易離解。實(shí)驗(yàn)提示，應(yīng)用壓電傳感器陣列技術(shù)可以判斷兩條互補(bǔ)鏈之間堿基不匹配情況，顯示其具有很好的特異性。116.不同結(jié)合位點(diǎn)對(duì)雜交效應(yīng)的影響靶序列分別在其3’端、5’端、及中間段與20堿基的探針互補(bǔ)雜交時(shí)，頻率差值無(wú)明顯差異，而中間段雜交時(shí)間有所延長(zhǎng)。127.不同探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效應(yīng)的影響在壓電傳感器上應(yīng)用較長(zhǎng)的DNA分子進(jìn)行雜交檢測(cè)時(shí)，頻率效應(yīng)更大，能更清楚地反映雜交情況，使實(shí)驗(yàn)誤差更小。138.靶序列長(zhǎng)度對(duì)雜交效應(yīng)的影響短鏈靶序列(20~108個(gè)堿基)堿基數(shù)與△ｆ呈線性關(guān)系，而長(zhǎng)鏈靶序列(225、379、654bp)時(shí)△ｆ增大趨勢(shì)明顯減緩。149.金、銀膜作傳感器電極檢測(cè)對(duì)比檢測(cè)基因時(shí)的穩(wěn)定性、反應(yīng)時(shí)間、頻率變化幅度以及雜交動(dòng)力學(xué)測(cè)定等方面均無(wú)顯著差異。1510.掃描隧道顯微鏡觀察針尖為電化學(xué)腐蝕的鎢絲，以恒電流方式進(jìn)行圖像采集，在大氣壓和室溫條件下，在納米級(jí)水平直接觀察金屬膜表面形態(tài)學(xué)變化。16銀膜空白電極照片。掃描范圍2nm×2nm石英晶片上銀原子分布均勻，排列有序

1.0uM、20堿基的探針固定在銀膜上，6-巰基己醇封閉。掃描范圍40nm×40nmDNA探針?lè)肿臃植季鶆?，密度較大。由于顯微鏡在膜垂直方向上掃描幅度僅4nm，視野內(nèi)看不到巰基己醇分子。1.0uM、20堿基的探針與1.0uM、20堿基的靶序列雜交，銀膜。掃描范圍40nm×40nmDNA雙鏈分子分布均勻。與雜交前比較，視野內(nèi)分子密度增加，分子增粗。17二.壓電諧振陣列自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)

頻率采集電路計(jì)算機(jī)傳感器陣列振蕩電路參比傳感器電磁屏蔽系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)連接示意圖181.電路系統(tǒng)通道選擇電路壓電諧振電路差頻電路自動(dòng)增益電路溫度補(bǔ)償電路計(jì)數(shù)電路自動(dòng)尋址電路計(jì)算機(jī)接口電路19

壓電傳感器振蕩電路圖202.

2×5型傳感器陣列AT切型基頻10MHz晶膜直徑4.0mm靈敏度0.1ng2×５型石英諧振傳感器陣列示意圖

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21傳感器陣列及檢測(cè)系統(tǒng)

223.軟件系統(tǒng)數(shù)據(jù)多道采集模塊數(shù)據(jù)分析模塊數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)模塊結(jié)果報(bào)告模塊234.檢測(cè)儀包括系統(tǒng)組合、外型設(shè)計(jì)及配套部件等工作目前已初步成形。24四.檢測(cè)MRSA的應(yīng)用研究準(zhǔn)確而快速地檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)，是有效控制其流行的關(guān)鍵，目前主張從耐藥基因型進(jìn)行檢測(cè)診斷。應(yīng)用壓電傳感器陣列，同時(shí)檢測(cè)作為MRS耐藥標(biāo)志的mecA基因和金黃色葡萄球菌特有的femA基因，并與其它常用方法進(jìn)行了對(duì)比，探討應(yīng)用壓電傳感器陣列技術(shù)檢測(cè)MRSA的可行性。25統(tǒng)計(jì)分析顯示：頻率變化與靶DNA濃度顯著相關(guān)，呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，并有關(guān)系式：

mecA[C]＝0.0003×e0.0414△FfemA[C]＝0.0003×e0.0336△F26從本實(shí)驗(yàn)可知，與其它檢測(cè)方法相比，應(yīng)用壓電傳感器陣列檢測(cè)臨床基因樣品將有許多優(yōu)勢(shì)：①可以進(jìn)行液相雜交定量檢測(cè)②可以進(jìn)行DNA實(shí)時(shí)檢測(cè)③可以對(duì)多種DNA樣品同時(shí)檢測(cè)④特異性強(qiáng)⑤無(wú)污染27五.相關(guān)專利國(guó)內(nèi)專利組合靶基因自動(dòng)檢測(cè)方法及采用該方法的檢測(cè)儀.公開(kāi)號(hào):CN1261667A組合靶基因自動(dòng)檢測(cè)儀.申請(qǐng)?zhí)枺?9123576.2微型石英諧振陣列基因傳感器芯片.申請(qǐng)?zhí)枺?9123577.0國(guó)際專利組合靶基因自動(dòng)檢測(cè)方法及采用該方法的檢測(cè)儀.申請(qǐng)?zhí)枺篜CT/CN99/001921628六.論文發(fā)表及學(xué)術(shù)交流

美國(guó)微生物學(xué)會(huì)第100屆年會(huì)PiezoeletricGenosensorBasedonPCRAmplicationandApplicationtoDetectionofHumanPapillomavirusOncogene.2000年世界華人臨床生化會(huì)議(香港)ApplicationofPiezoelectricGenosensorTechniquesforRapidDetectionofHumanPapillomavirus.美國(guó)圣地亞哥世界基因芯片大會(huì)Applicationofpieoelectricgenosenortechinquesforrapiddetectionofhumanpapillomavius29組合靶基因自動(dòng)檢測(cè)儀快速檢測(cè)人乳頭瘤病毒.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.2000;23(5):264-266應(yīng)用壓電基因傳感器芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA.中華醫(yī)院感染雜志.2000,10(6):418-420壓電基因傳感器芯片技術(shù)在快速快速檢測(cè)人乳頭瘤病毒中的應(yīng)用.中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，1(1):23-24Multichannelpiezoimmunoassyfordetectionofbacteriaandvireuses.ChemicalJournalofChineseUniversityies.1999;20(Spl):487PiPiezoeletricGenosensorBasedonPCRAmplicationandApplicationtoDetectionofHumanPapillomavirusOncogene.ChemicalJournalofChineseUniversityies.1999;20(Spl):42030壓電基因傳感器的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)·臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)。2001,(4)壓電基因傳感器的構(gòu)建.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).已接收探針濃度對(duì)