Waters高效液相色譜維護(hù)與保養(yǎng)

Waters液相色譜維護(hù)保養(yǎng)以下課件是我在使用、操作、高效液相色譜儀十年中積累的經(jīng)驗(yàn)，以及集合外部學(xué)習(xí)的經(jīng)驗(yàn)所寫，如有講的不好、錯誤之處，請大家及時指出，我們共同學(xué)習(xí)！質(zhì)檢：Waters高效液相色譜常見故障與解析第一部分常用術(shù)語第二部簡述HPLC的組成第三部分主要講液相常見故障與解析|第四部分簡談示差檢測的原理第五部分：色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)第一部分術(shù)語1、液相色譜法：就是用液體作為流動相的色譜法。2、固定相：在色譜法中，靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相3、流動相：能運(yùn)動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相4、色譜圖：色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖?？v坐標(biāo)為信號強(qiáng)度（通常我們所說的樣品濃度），橫坐標(biāo)為保留時間。

5、基線：在無組分通過色譜柱時，檢測器的噪音隨時間變化而產(chǎn)生的曲線術(shù)語6、基線噪聲:沒有溶質(zhì)通過檢測器時，檢測器輸出信號的隨機(jī)擾動變化。（就是沒有打進(jìn)樣品而直接查看基線時所產(chǎn)生的雜峰）

7、基線漂移：基線隨時間的增加朝單一方向的偏離稱為漂移。反映的是信號連續(xù)的遞增和遞減。產(chǎn)生原因：電源電壓不穩(wěn)、色譜系統(tǒng)未達(dá)到平衡、固定相流失、流動相的變化、溫度和流量的波動術(shù)語8、色譜峰：色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線。9、峰底：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)間的直線10、峰高：在峰的兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離。

11、半峰寬（W1/2）：通過峰高的中點(diǎn)做平行與峰底的直線，與其峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)間的距離。

12、峰面積（A）：峰與峰底間的面積，又稱作響應(yīng)值。13、拖尾峰：后沿較前沿平緩的不對稱峰。14、前伸峰：前沿較后沿平緩的不對稱峰術(shù)語15、死時間（t0）:不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大之所需的時間16、保留時間（tR）：組分從進(jìn)樣到出峰最大之所需的時間。17、死體積（V0）：不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出峰最大之所需的流動相的體積18、柱外體積

：從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測器之間色譜柱以外的液路部分中流動相所占有的體積。19、淋洗體積

：從進(jìn)樣開始計(jì)算的通過色譜柱的實(shí)際淋洗體積術(shù)語20、反相色譜柱

反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）術(shù)語21、排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。它類似于分子篩的作用，按分子大小進(jìn)行分離。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。例如：我們常用的

ks-802色譜柱第一部分術(shù)語22、面積歸一法：將所有峰的面積總和定為1，測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。是包含水分在內(nèi)的一個計(jì)算結(jié)果。第一大部分術(shù)語23.面積外標(biāo)法：外表法就是用標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積或峰高與其對應(yīng)的濃度做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,測出樣品的峰面積或峰高,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的濃度,這是最常用的一種定量方法通過進(jìn)標(biāo)樣建立一個校正曲線（一般是6針標(biāo)樣）。校正曲線的橫坐標(biāo)是標(biāo)樣的濃度（含量），縱坐標(biāo)是峰面積；校正曲線就相當(dāng)于：Y=aX+b的公式。校正曲線建立好后樣品的峰面積帶入方程就可以得到相應(yīng)的濃度（含量）。數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)泵以及流動相進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣閥分離系統(tǒng)-色譜柱檢測系統(tǒng)11第二部分HPLC的組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Waters515泵輸液系統(tǒng)——輸13輸出流量恒定壓力平穩(wěn)足夠的動力高壓輸液泵Waters2414示差檢測器15檢測系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)16手動進(jìn)樣數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)N2000色譜工作站18第三部分液相常見故障及解決方案19從泵的壓力變化推測

原因解決方法1、電源問題1、接通電源，開機(jī)2、保險絲被燒壞2、更換保險絲3、柱塞桿折斷4、更換柱塞桿4、泵頭內(nèi)有空氣5、啟動泵抽出空氣5、流動相不足6、吸濾頭堵5、補(bǔ)充流動相6、更換或超聲入口濾頭7、單向閥損壞7、更換單向閥8、漏液8、擰緊或更換手緊接頭A、泵內(nèi)沒有壓力顯示，沒有流動相流動20從壓力變化推測

原因解決方法1、電源問題1、接通電源，開機(jī)2、保險絲被燒壞2、更換保險絲3、柱塞桿折斷4、更換柱塞桿4、泵頭內(nèi)有空氣5、啟動泵抽出空氣5、流動相不足6、吸濾頭堵5、補(bǔ)充流動相6、更換或超聲入口濾頭7、單向閥損壞7、更換單向閥8、漏液8、擰緊或更換手緊接頭A、沒有壓力顯示，沒有流動相流動21原因解決方法1、柱塞桿折斷1、更換柱塞桿2、壓力傳感器損壞2、更換壓力傳感器B、流動相流動正常，但沒有壓力顯示B、泵內(nèi)有液流出，但使沒有壓力顯示22原因解決方法1、流速設(shè)定過高1、調(diào)整流速設(shè)定2、柱前篩板堵塞2、a、反沖色譜柱

b、更換色譜柱3、流動相使用不當(dāng)或緩沖鹽的結(jié)晶沉淀3、a、使用恰當(dāng)?shù)牧鲃酉?/p>

b、沖洗色譜柱4、色譜柱選擇不當(dāng)4、選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱5、柱溫過低5、提高溫度6、保護(hù)柱阻塞6、清洗或更換保護(hù)柱7、在線過濾器阻塞7、清洗或更換在線過濾器C、壓力高“堵”23原因解決方法1、流速設(shè)定過低1、調(diào)整流速2、系統(tǒng)漏液2、確定漏液位置并維修3、色譜柱選擇不當(dāng)3、選擇恰當(dāng)?shù)纳V柱4、柱溫過高4、降低溫度5、壓力傳感器或工作站失常5、更換壓力傳感器，重裝工作站或系統(tǒng)。D、壓力低“漏”24H、壓力波動原因解決方法1、泵中有氣體1、a、溶劑脫氣

b、從泵中除去氣體2、單向閥損壞2、超聲或更換單向閥3、泵密封損壞3、更換泵密封圈4、系統(tǒng)漏液4、確定漏液位置并維修5、使用梯度洗脫5、由于流動相粘度的變化引起，充分平衡系統(tǒng)

E、壓力波動25從色譜圖的異常情況推測A、基線漂移原因解決方法1、溫度變化1、室內(nèi)恒溫，或使用柱溫箱2、系統(tǒng)未平衡2、充分用流動相平衡3、流動相組成變化3、溶劑瓶密封，現(xiàn)用現(xiàn)配4、梯度洗脫4、空白梯度充分平衡系統(tǒng)5、色譜柱鍵合相流失5、更換色譜柱26B、基線噪聲“氣泡，污染”原因解決方法1、系統(tǒng)內(nèi)存在氣泡（流動相，檢測器，管路，泵）1、流動相脫氣，沖洗系統(tǒng)2、系統(tǒng)污染2、逐一排查，沖洗系統(tǒng)3、流動相不互溶3、選擇互溶的流動相4、混合器混合效果不好4、維修或更換混合器，或者不走梯度時用單一泵5、氘燈能量不足5、更換氘燈27C.保留時間變化“柱壓，流速”原因解決方法1、溫度變化1、室內(nèi)恒溫，或使用柱溫箱2、系統(tǒng)未平衡2、充分用流動相平衡3、流動相組成變化3、溶劑瓶密封，現(xiàn)用現(xiàn)配4、色譜柱污染4、強(qiáng)溶劑洗脫5、色譜柱壽命6、流速變化7、柱壓變化5、更換色譜柱6、排查引起流速改變的因素7、排查引起柱壓改變的因素如何判斷入口單向閥是否正常的簡易方法？

在泵運(yùn)行過程中將溶劑吸濾頭從流動相中拿出，放進(jìn)一小段氣泡進(jìn)入溶劑管路，進(jìn)行觀察。氣泡運(yùn)行狀態(tài)判斷措施一走一停正常一走一停一退入口單向閥受到污染，單向效果不好，有部分回流超聲清洗一走一退入口單向閥失效，無單向作用清洗或更換樣品處理：使用流動相溶解樣品，保證樣品的溶解度，減少

溶劑峰；

進(jìn)樣前使用0.45um或更小的膜進(jìn)行過濾。手動進(jìn)樣：應(yīng)使用液相色譜專用平頭進(jìn)樣針

吸液至少大于5-10倍定量環(huán)體積

轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置29進(jìn)樣的注意事項(xiàng)2414示差檢測器原理示差檢測器是基于連續(xù)測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動相的折光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比示差折光檢測器原理檢測器的光路是由光源、凸鏡、檢測池、反射鏡、平板玻璃、雙光敏電阻等主要部件組成，檢測池有參比，測量兩個池室，它們對光路來說是串聯(lián)的。示差檢測器原理第四部分色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)1、鈣柱：此色譜柱由鈣基樹脂填裝而成，氫離子或其它離子會取代鈣離子，或是引起與柱中糖的轉(zhuǎn)換，尤其是像蔗糖這樣易于轉(zhuǎn)換的糖，因此推薦在流動相中加入一定量的鈣離子不保持平衡和防止與樣品的轉(zhuǎn)換。

要保持裝流動相的瓶子干凈，有蓋子，且新鮮，流動相需要每24小時重新配制。新的鈣柱使用注意事項(xiàng)2新色譜柱的使用：為了保證新柱子能在分析使用之前得到足夠的鈣離子的平衡1）將柱子按照通常使用的反方向安裝（標(biāo)簽上的箭頭指向柱子的入端口）；2）用至少100ml的0.001MEDTA鈣鹽溶液在90℃用0.5ml/min流速反沖柱子，500mg/L的鈣鹽的濃度大約為0.001M；

3）將柱子反過來（回到通常的流動方向）用分析所用流動相沖柱子，（用與上一上步驟同樣的條件）直到基線平穩(wěn)方可使用。

鈣柱再生的時間3、柱子再生的時間：根據(jù)相關(guān)的樣品含有較多重金屬和過渡金屬元素或是有機(jī)酸的樣品越是需要經(jīng)常地對柱子進(jìn)行再生，因?yàn)樗鼈儠c柱子發(fā)生轉(zhuǎn)換。

檢測是否需要再生可以通過注射蔗糖來測試柱子的置換，如果蔗糖的峰有明顯拖尾，那么柱子需要做以下處理：第四部分色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)4柱子的再生步驟：1）

配制500ml的再生溶液（500mgEDTA_Ca/L

2）

把柱子流路方向反過來，在90℃下以0.5ml/min的流速沖洗一整夜；

3）

再生之后回到正常方向使用。

當(dāng)柱子反沖時，很重要的一點(diǎn)是需要保持溶劑的溫度從而確保正確的沖洗，用冷的溶劑將會延緩沖洗的過程。使用鈣柱注意的事項(xiàng)5、通常推薦壓力不超過2000psi，最大流速不超過0.6ml/min(70℃)。

⊙不要在流動相中使用氯化鈣，硝酸鈣以及其它強(qiáng)酸的鈣鹽，這樣會腐蝕柱子，破壞填料。⊙柱子的溫度不要超過95℃。通常高溫會帶來高的分辨率，但在90~95℃之間幾乎沒有變化，70℃以下對許多糖的異構(gòu)體的分離不能提供足夠的分離度，對于乙醇的定量，柱溫應(yīng)在75℃KS-802鈉型柱新色譜柱鈉型柱以ks802柱子為代表：1、新色譜柱的使用：為了保證新柱子能在分析使用之前要得到足夠的鈉離子的平衡1）將柱子按照通常使用的反方向安裝（標(biāo)簽上的箭頭指向柱子的入端口）；2）用至少100ml的0.002MNAOH溶液在50℃用0.2ml/min流速反沖柱子，4h以上。

3）將柱子反過來（回到通常的流動方向）用分析所用流動相沖即無二氧化碳的純水沖洗柱子，（用與上一上步驟同樣的條件）直到基線平穩(wěn)方可使用。

KS-802色譜柱再生的時間柱子再生的時間：根據(jù)相關(guān)的樣品含有較多重金屬和過渡金屬元素或是有機(jī)酸的樣品越是需要經(jīng)常地對柱子進(jìn)行再生，因?yàn)樗鼈儠c柱子發(fā)生轉(zhuǎn)換。

檢測是否需要再生可以根據(jù)注入木糖標(biāo)樣或進(jìn)行測試柱效時用到的2.5%乙二醇來檢測，如有明顯拖尾或者柱子理論踏板明顯降低那么柱子需要做以下處理：KS-802色譜柱的再生柱子的再生步驟：1）

配制500ml的再生溶液（0.2mol/LNAOH溶液

2）

把柱子流路方向反過來，在35℃、0.2ml/min的流速沖洗一整夜；

3）

特別注意用水沖洗系統(tǒng)的時候，一定先把砂芯過濾頭先放入純水超聲，沖洗至ph中性為止，然后再生之后回到正常方向，用無二氧化