細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

細(xì)胞培養(yǎng)孫國(guó)杰1.1前言（一）細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)（1）研究對(duì)象是活的細(xì)胞。（2）研究的條件可以人為地控制。（3）研究的樣本，具有均一性。（4）研究的內(nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄。（5）研究的范圍比較廣。（6）研究的費(fèi)用相對(duì)經(jīng)濟(jì)。（二）研究的方面（1）細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)：（2）細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外界之間的作用：（3）細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用：（4）細(xì)胞內(nèi)的流動(dòng)：（5）遺傳學(xué)：（三）應(yīng)用領(lǐng)域（1）病毒學(xué)（2）免疫學(xué)（3）遺傳學(xué)（4）腫瘤學(xué)（5）分化與發(fā)育（6）細(xì)胞毒試驗(yàn)（7）臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù)方面的應(yīng)用

1.2培養(yǎng)細(xì)胞的特征培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型（一）貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞

（1）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞：（2）上皮型細(xì)胞:

（3）游走型細(xì)胞（4）多形型細(xì)胞（二）懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞

懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞：血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。這類細(xì)胞特點(diǎn)：胞體始終是球形、密度較高，培養(yǎng)效率高、易大規(guī)模生產(chǎn)。1.2.2細(xì)胞增殖的特點(diǎn)貼附

(1)一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。

(2)促吸附因子：層連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子可能參與細(xì)胞貼附過(guò)程。

(3)A細(xì)胞-細(xì)胞黏附分子，主要與相應(yīng)的細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)；B細(xì)胞與底物由整合素所介導(dǎo)；C跨膜蛋白多糖，與基質(zhì)成分如其他蛋白多糖或膠原相互作用運(yùn)動(dòng)的接觸抑制及增殖的密度抑制（1）當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞移動(dòng)而互相靠近時(shí)，其中一個(gè)或兩個(gè)將停止移動(dòng)并向另一方向離開(kāi)，這保證兩個(gè)細(xì)胞將不會(huì)重疊。（2）細(xì)胞生長(zhǎng)的密度抑制。培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程

細(xì)胞周期間期

1、前期：形成染色體

2、中期:得到完整的染色體群3、后期:4、末期

細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程原代期傳代期衰退期1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。組織塊培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)2．傳代期

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。初代培養(yǎng)細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系）老化傳代期02468101214周16141210863．衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。二培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法

A培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法

所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法，就是將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再放人培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

早期的培養(yǎng)瓶是玻璃培養(yǎng)瓶，目前主要用一次性的塑料培養(yǎng)瓶。與一般瓶子不同，采用的材料都是透明、對(duì)生物細(xì)胞無(wú)毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形狀主要采用適合細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和顯微鏡觀察的扁平形狀。

與此相關(guān)的一種方法是蓋玻片+培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，就是以蓋玻片為生長(zhǎng)表面，將擬培養(yǎng)的組織、細(xì)胞接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。這樣具有以下幾優(yōu)點(diǎn)：。

(1)可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響。

(2)可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。（3）增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。B培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法曾被稱為微量培養(yǎng)法，是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)最為常用的方法之一。具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔和96孔培養(yǎng)板，后者最為常用。一般都是一次性使用。原代培養(yǎng)包括：取材、分散細(xì)胞、接種、培養(yǎng)等．在所有操作中，多都要注意保持培養(yǎng)物及生長(zhǎng)環(huán)境的無(wú)菌條件。組織塊也可用兩只手術(shù)刀片將組織塊切碎，這樣對(duì)細(xì)胞損傷較小，但操作時(shí)間長(zhǎng)，容易污染。對(duì)某些軟組織如腫瘤、胚眙、腦等可將碎組織塊放人注射器玻璃管中擠壓分離。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種：1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。傳代培養(yǎng)2．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。3．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代貼壁細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。1.首先將超凈工作臺(tái)用紫外

光燈照射滅菌20-30分鐘；

貼壁細(xì)胞傳代-消化過(guò)程2.關(guān)閉超凈工作臺(tái)內(nèi)的紫外光燈,點(diǎn)燃酒精燈(一切操作均需在酒精燈火焰下進(jìn)行)

3.將消毒過(guò)的所用物品放入超

凈工作臺(tái)中；

4.將培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

皿放入超凈工作臺(tái)中；5.用無(wú)菌吸管將細(xì)胞上原有的

培養(yǎng)液吸凈，棄去培養(yǎng)液。

6.分別取1毫升0.25%胰酶消化液放入培養(yǎng)皿中7.將加有胰酶消化液的培養(yǎng)皿

放入37℃溫箱中消化1分鐘

8.從溫箱中取出培養(yǎng)皿后

用手輕輕拍打培養(yǎng)皿的邊緣；

9.用倒置式顯微鏡觀察細(xì)胞

是否完全脫落細(xì)胞完全皺縮變圓，此時(shí)應(yīng)棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細(xì)胞從細(xì)胞瓶壁上洗下，將細(xì)胞懸液用吸管吹散后傳代：

有經(jīng)驗(yàn)后，可肉眼對(duì)光觀察貼壁半透明的細(xì)胞層，判斷消化程度。10.待細(xì)胞完全脫離后，加入適量的含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)如消化過(guò)頭，會(huì)見(jiàn)到許多細(xì)胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失。也可以在倒數(shù)第二、三步時(shí)棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續(xù)作用至最后一步的消化程度，這樣略有點(diǎn)過(guò)也影響不大。剛加入胰酶，細(xì)胞仍呈致密單層：

細(xì)胞開(kāi)始皺縮但不明顯，仍維持細(xì)胞正常形態(tài)：

細(xì)胞基本皺縮變圓，此時(shí)細(xì)胞吹打可下：

檢查細(xì)胞形態(tài)及活力：狀態(tài)良好的細(xì)胞應(yīng)是輪廓不十分清晰，而生長(zhǎng)不良的細(xì)胞輪廓反而清晰，細(xì)胞間隙增大，有空泡、脂滴、顆粒出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。檢查營(yíng)養(yǎng)液PH及污染：新鮮的呈桃紅色，PH在7.2-7.4之間。培養(yǎng)一段時(shí)間后，PH下降，培養(yǎng)液變黃。ＣＯ２培養(yǎng)箱可自動(dòng)控制5%ＣＯ２的含量。細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)程序

用酒精沖洗計(jì)數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計(jì)算板上，微微移向一側(cè)，以便滴加細(xì)胞懸液.取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻。從蓋片邊緣滴加細(xì)胞懸液，使其充滿計(jì)數(shù)板和蓋片間的空隙中。注意：勿使液體漫過(guò)蓋片或出現(xiàn)氣泡。鏡下觀察計(jì)數(shù)：計(jì)算計(jì)數(shù)板四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者只計(jì)算左側(cè)和上方的,右側(cè)和下方的不計(jì)算在內(nèi)。

按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/毫升原液=

注意：鏡下計(jì)數(shù)，有時(shí)偶爾有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如細(xì)胞團(tuán)占10%以上,說(shuō)明消化不充分；細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10平方毫米或多于500個(gè)/10平方毫米

時(shí)，均說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新置備細(xì)胞懸液,再計(jì)算。細(xì)胞計(jì)數(shù)：

細(xì)胞懸液制備后，要計(jì)算所含的細(xì)胞數(shù)量。一般以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。用品：細(xì)胞懸液,培養(yǎng)液,計(jì)數(shù)板。

1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

計(jì)數(shù)法:

尋根問(wèn)底胰蛋白酶真的不會(huì)把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長(zhǎng)時(shí)間的作用也會(huì)消化細(xì)胞膜蛋白，對(duì)細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時(shí)間。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代小結(jié)加消化液得到分散的單細(xì)胞

倒掉消化液

加培養(yǎng)液終止消化吹打成細(xì)胞懸液接種2-4個(gè)培養(yǎng)瓶生長(zhǎng)貼壁培養(yǎng)的材料與系統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的表面要求具有凈陽(yáng)電荷和高度的表面活性。如果是有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽(yáng)電荷。主要材料有：玻璃、塑料、金屬、微載體。貼壁培養(yǎng)的系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)的核心是采用可以搖動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)的圓筒培養(yǎng)容器，能使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣。但是，該系統(tǒng)具有表面積有限、培養(yǎng)條件檢測(cè)受到限制、勞動(dòng)強(qiáng)度大、占用空間大等不足。凡·維茨爾開(kāi)發(fā)的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)一定程度上克服了這些缺陷。微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞是一種適合大規(guī)模生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞生物制品的一種非常有價(jià)值的培養(yǎng)技術(shù)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)特性原本為圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就可鋪滿生長(zhǎng)表面，形成致密的細(xì)胞單層。這種方法易于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，適宜于實(shí)驗(yàn)室研究。但是如需繼續(xù)培養(yǎng)，需將單層細(xì)胞再分散，稀釋后再重新接種，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞一般生長(zhǎng)過(guò)程是：

(1)游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，由于細(xì)胞質(zhì)的回縮，各種形狀的細(xì)胞都開(kāi)始變圓。

(2)吸附期：細(xì)胞類型不同，貼壁時(shí)間有所差異。單個(gè)細(xì)胞、傳代細(xì)胞較快，組織塊、較大細(xì)胞團(tuán)較慢。一般多數(shù)細(xì)胞都可在24h內(nèi)貼壁，平均貼壁時(shí)間大約5-20min。而細(xì)胞狀態(tài)不好及瀕死細(xì)胞、培養(yǎng)基偏酸或偏堿、培養(yǎng)瓶不潔等不利條件都不利于細(xì)胞貼壁。

(3)繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞，此時(shí)雖有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，卻無(wú)細(xì)胞分裂。經(jīng)過(guò)一段停滯，開(kāi)始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞間開(kāi)始接觸并連接成片，這時(shí)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及分裂都會(huì)停止。這種由于細(xì)胞間的接觸而發(fā)生抑制的現(xiàn)象稱之為接觸性抑制。

(4)退化期：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁達(dá)到一定密度后，隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細(xì)胞開(kāi)始退化。細(xì)胞輪廓變強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)有膨脹的線粒體顆粒堆積。如不及時(shí)傳代，細(xì)胞會(huì)從瓶壁上脫下來(lái)。貼壁培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)(1)貼壁培養(yǎng)比較容易更換培養(yǎng)基。(2)容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的。(3)更有效地表達(dá)同一產(chǎn)品。(4)可以方便地調(diào)節(jié)培養(yǎng)液和細(xì)胞比例。(5)易于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況?！舅伎碱}】多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識(shí)，思考并討