煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立

實驗?zāi)康模?/p>

1.通過實驗，掌握無菌操作方法，熟悉煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立的整個過程。2.學(xué)習(xí)再生體系的建立方法，為掌握其他植物的組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)；同時為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供一個平臺。實驗十煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立

再生體系的建立主要應(yīng)用于以下幾個方面：

1、用于驗證植物細(xì)胞的全能性。

2、是植物基因工程的重要基礎(chǔ)，外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，受體細(xì)胞通過脫分化形成愈傷組織，愈傷組織通過再分化形成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。

3、也是植物快繁的一種方式，通過誘導(dǎo)愈傷組織再分化，能夠在短時間內(nèi)形成大量的不定芽或胚狀體，從而獲得大量的植株。實驗原理

分化了的植物葉片細(xì)胞往往具有全能性，因此將煙草葉片從植株上分離后，給予一定的培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)葉片細(xì)胞脫分化，脫分化的細(xì)胞不斷分裂就形成愈傷組織，愈傷組織再在合適的培養(yǎng)條件下又能夠再分化形成完整植株，煙草愈傷組織的再分化是以不定芽的方式，即愈傷組織先形成不定芽，再由不定芽形成完整植株，從而完成了再生體系的建立。實驗步驟一）材料的消毒：1）剪取生長健壯的葉片，最好帶有葉柄。2）將整個葉片（包括葉柄）全部浸入70％的乙醇中，不斷振蕩30s。3）將乙醇倒掉，迅速加入0.1％的升汞，再將整個葉片（包括葉柄）全部浸入0.1％的升汞中，不斷振蕩10min。4）于工作臺上用無菌鑷子將上述葉片夾入無菌燒杯中，同時將升汞倒入盛有硫化鈉的桶里。5）用無菌水沖洗上述葉片3－5遍，取出后用無菌濾紙吸干，備用。二）接種：在無菌的條件下，取煙草無菌苗的葉片（或上述消過毒的葉片），剪成（0.5～1cm）*(0.5～1cm)大小的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L中誘導(dǎo)愈傷組織，在此培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出愈傷組織并能夠誘導(dǎo)出不定芽。三）不定芽生根：將在愈傷組織中生成的不定芽移栽到1/2MS培養(yǎng)基中，其目的是誘導(dǎo)不定芽生根，使其發(fā)育成煙草小植株。

接種第一天

接種第二天，因為外植體細(xì)胞開始被誘導(dǎo)脫分化，并不斷分裂增殖，造成葉片中央與邊緣的細(xì)胞分裂不均勻，因此，葉片中央凸起。接種第五天，脫分化細(xì)胞不斷分裂增殖，形成愈傷組織，表現(xiàn)為葉片邊緣泛黃增厚，葉片中央進(jìn)一步凸起。接種第九天，脫分化細(xì)胞不斷增值，愈傷組織不斷增厚，整個葉片都翹起，并且已經(jīng)開始再分化形成綠色生長點。第九天（誘導(dǎo)生成愈傷組織）

接種第十九天，綠色生長點進(jìn)一步發(fā)育形成了不定芽，不定芽長度最長可達(dá)1cm。第十