干細胞培養(yǎng)與鑒定

產(chǎn)品經(jīng)理：施真解析：干細胞的培養(yǎng)與鑒定

主要內容1.干細胞原代提取及鑒定2.干細胞培養(yǎng)體系與操作細節(jié)的重要性3.OricellTM系列干細胞產(chǎn)品及售后服務2原代培養(yǎng)過程3原代取材組織來源（個體年齡、健康狀況）

BMSC、ADSC：成人（18-45周歲）、大鼠和小鼠（4周齡）、兔和狗（1-3周齡）

NSC：大鼠（孕齡14.5天的胚胎）；小鼠（孕齡12.5天的胚胎）

ESC：小鼠（見栓后3.5天的孕鼠）取材部位

BMSC：髂骨或胸骨、后肢股骨和脛骨

ADSC：抽脂手術的脂肪組織或腹股溝

NSC：胚胎大腦GE區(qū)

ESC：囊胚內細胞團45間質干細胞（MSC）定義：來源于中胚層的早期細胞，能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細胞。來源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。6廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內可分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。神經(jīng)干細胞（NSC）7胚胎干細胞(embryonicstemcellES,細胞)是指胚泡期的內細胞團中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細胞無限增殖、自我更新可分化為三個胚層來源的各種組織及細胞類型胚胎干細胞（ESC）分離細胞分離方法的選擇BMSC：密度梯度離心法（人、猴、狗）

貼壁篩選法（大鼠、小鼠、兔）ADSC：膠原酶消化法NSC：無血清培養(yǎng)基自然篩選法ESC：囊胚內細胞團遷移法8密度梯度離心法密度梯度離心法：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。試劑：

Ficoll淋巴細胞分離液，分離出密度在1.077±0.001g/L之間的淋巴細胞9用1xPBS按照

1：1的比例稀釋骨髓；稀釋后的骨髓沿離心管壁緩慢鋪到淋巴細胞分離液上；離心；離心完畢，小心吸取中間云霧狀單個核細胞層；離心，加入培養(yǎng)基重懸接種；3天之后首次換液；其后，每隔2-3天換液；待細胞到80%融合的時候進行傳代。10密度梯度離心法11取大鼠/小鼠的后肢股骨和脛骨；用1mL注射器吸入培養(yǎng)基后沖洗骨髓腔，將骨髓全部沖洗出來；骨髓懸液進行離心；棄上清，用培養(yǎng)基重懸細胞，接種到1個T25或者T75培養(yǎng)瓶中；3天后換液，以后每隔2-3天換液，待細胞80-90％融合時傳代。貼壁篩選法擴增傳代傳代時機的控制（MSC為例）細胞匯合度的判斷傳代消化時間的控制接種密度的控制培養(yǎng)體系的選擇12擴增傳代-細胞匯合度的判斷(MSC)

13擴增傳代-消化時間的控制(MSC)14細胞消化15s細胞消化35s細胞消化55s不同物種、細胞類型之間接種密度有差異MSC、ADSC：2×104/cm2~4×104/cm2NSC：1.0-2.0×105cells/mLESC：1×104/cm2~2×104/cm215擴增傳代-接種密度的控制純化鑒定16純化方法：多次傳代進行純化常規(guī)檢測：細菌、真菌檢測；支原體檢測；內毒素檢測；鑒定檢測：增殖能力、生長形態(tài)、特異性抗原表達、核型分析、誘導分化能力等常規(guī)檢測17鑒定檢測共通項目復蘇存活率

臺盼藍拒染法--如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。18鑒定檢測共通項目19細胞倍增時間：生長曲線測定（計數(shù)法或者CCK8法)細胞倍增的時間區(qū)間即細胞對數(shù)生長期，細胞傳代、實驗等多應在此區(qū)間進行。可在細胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細胞增加一倍所需的時間，即倍增時間。形態(tài)學表面抗原標記多向分化能力20MSC（間質干細胞）鑒定檢測MSC（間質干細胞）鑒定檢測形態(tài)學:梭形、成纖維樣細胞原代：克隆樣生長傳代后：均質、旋渦狀排列21HumanDogMonkeyMouseRatRabbitMSC（間質干細胞）鑒定檢測表面抗原標記（流式鑒定）：

MSCs屬混雜細胞群，其表面抗原也具有非專一性,它表達了間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志，如粘附因子、生長因子和細胞因子受體以及整合素家族等。22MSC（間質干細胞）鑒定檢測23MSC（間質干細胞）鑒定檢測誘導分化能力鑒定：成骨誘導（茜素紅染色）24誘導前（匯合度65%-70%）染色前成骨誘導25MSC（間質干細胞）鑒定檢測誘導分化能力鑒定：成脂誘導（油紅O染色）26誘導前（融合度90-95%）成脂染色前誘導分化能力鑒定：成軟骨誘導（阿利新藍染色、三維培養(yǎng)法）27MSC（間質干細胞）鑒定檢測染色前石蠟切片后染色圖片形態(tài)學特征：可做懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)特異性抗原表達：Nestin分化能力：神經(jīng)元、星形膠質細胞、少突膠質細胞28NSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測29大鼠神經(jīng)干細胞-懸浮培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細胞-懸浮培養(yǎng)NSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測-形態(tài)學30NSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測特異性抗原表達Nestin(神經(jīng)干細胞標志物)陽性表達率≥75%

β3-tubulin（神經(jīng)元標志物）陽性表達率

≤10%GFAP(星形膠質細胞標志物)陽性表達率≤10%GalC或OSP（少突膠質細胞標志物）陽性表達率≤10%31NSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測RatNSCnestinstainingMouseNSCnestinstaining分化能力自然分化

加入含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)約7天，可分化為神經(jīng)元、星型膠質細胞及少突膠質細胞。三者的分化比例約為(16±7)%，(75±7)%和(5±3)%。定向分化

1.神經(jīng)元方向分化：用無血清無生長因子誘導液誘導，可使分化比例升至60%以上。2.少突膠質細胞分化：加入T3或insulin可使分化比例大大提高。32NSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測33神經(jīng)元方向分化（TubulinStaining)星型膠質細胞方向分化（GFAPStaining)RatNSCNSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測34少突膠質細胞方向分化（OSPStaining）NSC（神經(jīng)干細胞）鑒定檢測形態(tài)學：集落樣或克隆樣生長特異性轉錄因子/抗原表達：表達OCT-4，Nanog；SSEA種屬間表達有差異染色體結構：傳代過程中保持正常穩(wěn)定的核型全能性：具有向胚胎的三個胚層來源的所有細胞分化的能力35ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測36小鼠ES：緊密牢固結合、多層密集立體生長，呈堆積狀，邊緣清楚，細胞核大、核仁明顯、核漿比高。

人ES：相對松散、扁平狀集落,集落內細胞界限隱約可見ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測-形態(tài)學有MEF

無MEF，無血清培養(yǎng)體系

特異性表達37抗原Oct-4NanogSSEA-1SSEA-3SSEA-4人ES++—++小鼠ES+++——ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測染色體結構核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型，小鼠（40，XX/XY)。不隨傳代次數(shù)而改變。38ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測39小鼠ES核型分析：40，XYESC（胚胎干細胞）鑒定檢測核型分析：顯色技術全能性體內分化：畸胎瘤實驗體外分化：EB（擬胚體）形成實驗40ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測體內分化41將細胞注射入（約106個）SCID（重癥聯(lián)合免疫缺陷）或裸鼠體內，約4周后（人ES可能需要8~10周），可見細胞注射處有腫塊生成，處死小鼠，腫瘤固定后做石蠟包埋，切片，普通HE染色后觀察。ES可在小鼠體內生長、分化、形成含有三個胚層來源的良性畸胎瘤。ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測體外分化42ESEB貼壁誘導約5~7天后出現(xiàn)自主性搏動ESC（胚胎干細胞）鑒定檢測43剛接觸干細胞，不知道該用什么培養(yǎng)基？費盡心血提取的干細胞養(yǎng)了幾代就老化了？原代取材雜細胞太多？細胞生長不均勻，有的地方密有的地方稀？操作其他細胞都沒問題，養(yǎng)干細胞就出現(xiàn)了污染？

………….干細胞培養(yǎng)體系與操作細節(jié)的重要性44

干細胞的研究和利用過程中，最主要的提供最適生長環(huán)境，保持培養(yǎng)開始時細胞群體的狀態(tài)，這就要求培養(yǎng)條件始終如一，近乎呆板地堅守細節(jié)和常規(guī)。

培養(yǎng)體系的選擇干細胞飼養(yǎng)員必備素質-細節(jié)決定成敗無菌意識，重中之重規(guī)范化的無菌操作超凈臺取用物品擺放、操作時細節(jié)問題環(huán)境的控制

培養(yǎng)箱的定期消毒、水浴鍋定期換水、大環(huán)境的控制等生物試劑使用前仔細閱讀產(chǎn)品說明書操作干細胞時動作輕柔復蘇、傳代、凍存等步驟重懸細胞的過程培養(yǎng)基使用前復溫、細胞接種之后搖勻、各種干細胞接種密度的控制、試劑保存時避免反復凍融等4546

干細胞細胞培養(yǎng)耗材、分子耗材培養(yǎng)基細胞因子

凍存液OricellTM系列干細胞產(chǎn)品及售后服務干細胞相關試劑及耗材47OricellTM系列無蛋白非程序凍存液4849細胞培養(yǎng)耗材的選擇干細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶

（特殊TC處理表面，更適用于干細胞的貼壁培養(yǎng)）神經(jīng)元/神經(jīng)干細胞培養(yǎng)板

（多肽包被，無需PLL/Laminin預處理，保存時間長）15ml、50ml離心管（透明度更高、耐更高轉速）分子生物學耗材（

Labcon系列）全美進口●55周年歷史●FDA/USP認證吸頭微量離心管PCR產(chǎn)品系列儲樣管、儲樣架等OricellTM系列耗材Cyagen團隊特別針對免疫