微生物細胞破碎2-4

2023/2/5生物分離過程的一般流程本節(jié)內(nèi)容2023/2/5微生物細胞破碎celldisruption第一節(jié)細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)第二節(jié)常用破碎方法第三節(jié)破碎率測定第四節(jié)包涵體的純化方法2023/2/5知識點：細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，微生物細胞的破碎技術(shù)，破碎率的測定。重點：工業(yè)生產(chǎn)中常用的幾種細胞破碎方法的原理，操作過程常用設(shè)備，并能就實際生產(chǎn)情況予以合理的選擇。難點：常用破碎方法的合理選用。2023/2/5概述(目的和意義)細胞破碎（cellrupture）是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細胞破碎技術(shù)是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。為了研究細胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。2023/2/5第一節(jié)細胞壁的組成與結(jié)構(gòu)不同細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同。2023/2/51、細菌細胞壁結(jié)構(gòu)細菌的細胞壁都是由肽聚糖、胞壁酸、蛋白質(zhì)、脂多糖等組成；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細胞周圍。2023/2/5破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和交聯(lián)的程度。革蘭氏陰性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽性菌有很大不同。

革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過這種細胞生產(chǎn)了很多細胞重組的產(chǎn)物。藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細胞白血病等2023/2/5

2、酵母細胞壁結(jié)構(gòu)最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構(gòu)成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀；中間一層是糖蛋白；最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復合物；破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。2023/2/53、真菌細胞壁真菌的細胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類。不同的真菌，細胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，少數(shù)含纖維素。與酵母和細菌的細胞壁一樣，真菌細胞壁的強度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強度有所提高。2023/2/5紅面包霉菌細胞壁具有同心圓層狀結(jié)構(gòu)主要存在三種聚合物最外層(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第3層(c)主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層(d)主要是幾丁質(zhì)。紅面包霉菌細胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖4、植物細胞壁構(gòu)架物質(zhì)：纖維素基質(zhì)：果膠典型結(jié)構(gòu)：胞間層初生壁次生壁2023/2/5微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)2023/2/5第二節(jié)細胞破碎技術(shù)2023/2/5機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法

物理破碎溫差破碎法壓差破碎法化學破碎有機溶劑表面活性劑酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞細胞破碎方法及其原理2023/2/5一、機械法高壓勻漿破碎法（homogenization）珠磨破碎法（beadgrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）2023/2/5采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）1、高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細胞破碎。2023/2/5高壓勻漿器的種類高壓勻漿器的種類較多：WAB公司的AVPGaulin31MR型Branandluebbe

公司SHL40型意大利Niro

Soavi高壓勻漿機2023/2/5高壓勻漿法使用時注意事項高壓勻漿器的操作溫度上升約２-３℃/10MPa為了控制溫度的升高，可在進口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右?？梢圆捎脝未瓮ㄟ^勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。2023/2/5高壓勻漿法適用的范圍（大規(guī)模細胞破碎的常用方法）☆適用范圍

酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎；料液細胞濃度可以很高，20%左右。☆不宜使用易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）2023/2/5壓力壓力增加可減少細胞的循環(huán)次數(shù)，最好一次通過就可完全的破碎。但p大到一定值時對勻漿器的磨損增加。工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55－70Mpa。菌體種類和生長環(huán)境大腸桿菌的細胞比酵母細胞容易破碎生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復雜培養(yǎng)基上容易破碎。影響高壓勻漿器細胞破碎因素2023/2/52）珠磨法beadmill細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。WSK臥式高效全能珠磨機2023/2/53）超聲波破碎（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz超聲波處理細胞懸浮液。在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用,液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力,引起的粘滯性旋渦在細胞上造成了剪切力，使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。2023/2/5JY92-IID超聲波細胞粉碎機超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種類型，一般破碎效果后者比前者好。破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。操作過程產(chǎn)生大量的熱，操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。2023/2/5適用范圍桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低。由于對冷卻的要求相當苛刻，且大規(guī)模操作中聲能傳遞和散熱有困難，不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。2023/2/5技術(shù)原理效果成本舉例勻漿法(孔型)須使細胞通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中細胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴細胞懸浮液小規(guī)模處理研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜不同機械破碎方法的比較2023/2/5二、非機械破碎方法酶溶破碎法（enzymelysis）化學破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化學法溶胞應(yīng)用最廣。酶溶破碎法（enzymelysis）化學破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化學法溶胞應(yīng)用最廣。酶溶破碎法（enzymelysis）化學破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）2023/2/51、酶解（酶溶法Enymaticlysis)

酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等2023/2/5外加酶法酶解法的特點是專一性強，必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學組成來選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，主要用于細菌類細胞壁的裂解。2023/2/5放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，可采用溶菌酶。酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。2023/2/52)酶解-自溶作用

自溶作用是利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。改變其生長環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。缺點：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。2023/2/5酶解法的特點

優(yōu)點發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細胞外形較完整缺點溶酶價格高溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)產(chǎn)物抑制的存在

2023/2/5有選擇性的加入某些化學試劑，可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇性地滲透出來。2、化學滲透法（Chemicalpermeation）取決于化學試劑類型以及細胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。

常用化學試劑有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等2023/2/5酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。（1）酸、堿處理法2023/2/5細胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等（2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解2023/2/5能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。（3）有機溶劑（4）EDTA螯合劑處理G-細菌，對細胞壁外層有破壞作用。G-細菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。非極性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸小分子氨基酸靜電引力可以滲透過細胞壁中，通過氫鍵、范德華力、靜電引力等化學親和力改變細胞壁結(jié)構(gòu)。（5）溫和化學滲透劑處理2023/2/5通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學試劑有毒；化學試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度?；瘜W滲透法特點缺點對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。優(yōu)點2023/2/53、物理法滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法干燥法2023/2/51）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。2023/2/52）凍結(jié)-融化法將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復多次達到破壁作用；一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂；適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。

2023/2/5使細胞結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥2023/2/52023/2/5三、選擇破碎方法的依據(jù)細胞壁強度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；細胞處理量；目標產(chǎn)物對破碎條件的敏感性；破碎程度；目標產(chǎn)物的選擇性釋放。2023/2/5四、選擇性釋放目標產(chǎn)物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標產(chǎn)物的位置周圍當目標產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用較溫和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。當目標產(chǎn)物存在于細胞質(zhì)內(nèi)時，則需采用強烈的機械破碎法．當目標產(chǎn)物處于與細胞膜或細胞壁結(jié)合的狀態(tài)時，調(diào)節(jié)溶液pH值，離子強度或添加與目標產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標產(chǎn)物容易溶解釋放。2023/2/5(2)機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標產(chǎn)物釋放率條件下，降低細胞的破碎程度。2023/2/5

討論題：青霉素?；讣毎扑榈难芯?/p>

一.化學法

20%(W/V)大腸桿菌懸浮液+B.A37℃攪拌高速離心

測上清液酶活。1.處理時間

R%

2.5h2.丁酯用量條件：37℃，攪拌3小時適宜的B.A加量為12%，釋放率R=40%12%55%R

%12%2.03U/mg比活2023/2/5二.化學法—凍融法結(jié)合

加B.A(12%,37℃攪拌3h）菌懸液凍融(凍結(jié)14h，

融化)釋放率—55%；比活—2.69u/mg

三.化學—超聲波振蕩法結(jié)合

先丁酯處理，再超聲波（90秒），釋放率72%，小型設(shè)備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。四.高壓勻漿法

20%(W/V)菌懸液，ΔP=50MPa，N=3。釋放率R=38.4%，原因:細胞破碎后,仍有較多酶吸附在細胞碎片上。2023/2/5五.高壓勻漿—化學法結(jié)合

先高壓勻漿，再加10%丁酯，37℃攪拌3h，高速離心(3萬rpm)，釋放率：R=75%第三節(jié)破碎率的測定及破碎技術(shù)

的研究方向2023/2/5細胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導電率上升。直接測定法目的產(chǎn)物測定法3)導電率測定法采用染色法區(qū)別破碎的細胞與未破碎的細胞如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。將破碎后的細胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標準值比較，計算其破碎率。一、破碎率的測定2023/2/5二、破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合化學法、酶法、機械法相結(jié)合。酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結(jié)合如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。有機溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合2023/2/5破碎技術(shù)的研究方向

-與上游過程相結(jié)合在生長后期，加入某些能抑制或阻止細胞壁物質(zhì)合成的抑制劑(如青霉素)，使新生細胞細胞壁有缺陷，利于破碎；選擇較易破碎的菌種作為宿主細胞，如革蘭氏陰性細菌；用基因工程的方法對菌種進行改造。2023/2/5破碎技術(shù)研究方向-與下游工程相結(jié)合

舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶2023/2/5（inclusionbodiesIBs)第四節(jié)包涵體的純化胞外分泌型表達：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內(nèi)表達：胞內(nèi)可溶性表達：離心,收集菌體→細胞破碎→離心，收集上清→純化。胞內(nèi)周質(zhì)表達：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標蛋白變性溶解→復性→純化。2023/2/5生物分離過程的一般流程本節(jié)內(nèi)容2023/2/5外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體2023/2/5包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。包涵體的形成的原因？蛋白過量積聚，超過溶解度，導致沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀；分子內(nèi)部二硫鍵的錯誤連接導致沉淀；表達蛋白過多，與其結(jié)合/誘導組分不足，不能形成溶解狀態(tài)；蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包涵體的構(gòu)成2023/2/5基因工程包涵體的純化方法收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌目標蛋白的變性溶解目標蛋白的復性包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應(yīng)有的天然活性。2023/2/51）包涵體的洗滌細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）