木瓜蛋白酶提取實(shí)驗(yàn)PPT

木瓜蛋白酶的提取、分離純化及生物學(xué)研究木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，分子量為23406，含212個(gè)氨基酸殘基的單肽鏈最適PH值6-7，等電點(diǎn)為8.75，耐熱，受氧化劑抑制，還原性物質(zhì)激活未成熟番木瓜乳汁中含量最多木瓜蛋白酶提取純化的方法超濾法（實(shí)驗(yàn)室條件不支持，得率較低）鹽析法（純度相對較高，但大量的鹽，降低了木瓜蛋白酶的活性）絮凝法（酶純度不高，雜質(zhì)含量較高。）超聲波法、親和膜色譜法、雙水相萃?。▽?shí)驗(yàn)室條件不支持、且耗時(shí)長、技術(shù)難度較高）因此根據(jù)酶的理化性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室的條件、操作可行性、時(shí)間等條件綜合考慮，提取本實(shí)驗(yàn)方案，力求最大限度利用現(xiàn)有資源。來達(dá)到較高活力回收、高純度的分離純化的目的。有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)溶解度的降低，另外，有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，降低其溶解度

硫酸銨分級沉淀法：

高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。實(shí)驗(yàn)原理取木瓜乳汁過濾粗提（酶液1）20％硫酸銨一次純化45％硫酸銨二次純化（酶液4’）60％乙醇純化（酶液9’）透析除鹽（酶液9’’）60％乙醇純化（酶液5’）20％硫酸銨一次純化45％硫酸銨二次純化（酶液8’)透析除鹽(酶液8’’)硫酸銨+乙醇乙醇+硫酸銨粗提取木瓜乳汁5ml，加蒸餾水至100ml攪拌1小時(shí)紗布過濾

3500轉(zhuǎn)/min離心15min,留上清20％硫酸銨一次純化45％硫酸銨二次純化取20ml上清加2ml酶保護(hù)劑，加飽和硫酸銨5.5ml使其達(dá)到飽和度的20%12.5ml,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min，取上清加飽和硫酸銨12.5ml使其達(dá)到飽和度的45%,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min,取沉淀，10ml蒸餾水稀釋，60％乙醇純化透析加入1ml眉保護(hù)劑，加18.6ml的冷無水乙醇使其濃度達(dá)到60%，調(diào)節(jié)PH為6.0，靜置過夜4000轉(zhuǎn)離心30min，取沉淀，加10ml蒸餾水稀釋透析，將稀釋液裝入處理好的透析袋中，透析袋置于裝蒸餾水的大燒杯中，在搖床上震搖，每半小時(shí)更換一次蒸餾水，至燒杯中蒸餾水滴加到氯化鋇溶液中無白色沉淀生成，取出透析袋里的酶液，測濃度及酶活粗提取木瓜乳汁5ml，加蒸餾水至100ml攪拌1小時(shí)紗布過濾

3500轉(zhuǎn)/min離心15min,留上清60％乙醇純化取20ml上清加2ml酶保護(hù)劑，33ml冷無水乙醇使其濃度達(dá)到60%調(diào)節(jié)PH為6.0，4攝氏度靜置過夜20％硫酸銨一次純化45％硫酸銨二次純化透析4000轉(zhuǎn)離心30min，取沉淀，加10ml蒸餾水稀釋加1ml酶保護(hù)劑，加飽和硫酸銨2.55ml使其達(dá)到飽和度的20%,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min，取上清加飽和硫酸銨5.68ml使其達(dá)到飽和度的45%,靜置30min，4000轉(zhuǎn)離心30min,取沉淀，10ml蒸餾水稀釋透析。將稀釋液裝入處理好的透析袋中，透析袋置于裝蒸餾水的大燒杯中，在搖床上震搖，每半小時(shí)更換一次蒸餾水，至燒杯中蒸餾水滴加到氯化鋇溶液中無白色沉淀生成，取出透析袋里的酶液，測濃度及酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶活力單位（U）定義：每分鐘水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

酪蛋白ml酶液ml

三氯乙酸ml

酶液ml

吸光度待測液5.0150度水預(yù)熱10min5.050度水預(yù)熱10min/靜置10min

充分過濾，濾液以水為對照在275nm處側(cè)吸光值A(chǔ)空白對照

5.0

/

5.0

1.0

A0酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液取酪氨酸溶液，以蒸餾水為空白，測定吸光度An

編號吸光度值稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值濃度（ug/ml)測得蛋白質(zhì)濃度(ug/ml)體積(ml)蛋白質(zhì)（酶）含量(mg)硫酸銨+乙醇10.67650016.918455.020.00169.1粗提20.61550015.357675.027.50211.1硫酸銨一次純化上清4'0.2925007.093545.010.0035.5硫酸銨二次純化沉淀9'0.2285005.462730.010.0027.3乙醇沉淀編號稀釋倍數(shù)待測管吸光度對照管吸光度絡(luò)氨酸標(biāo)準(zhǔn)液酶活(u)蛋白質(zhì)（酶）含量(mg)酶比活(u/mg)硫酸銨+乙醇110000.01.3480.3280.57968,911.9169.1410.0粗提213750.00.2700.22657,469.80211.1270.0硫酸銨一次純化上清4’5000.00.2740.19338,471.535.51090.0硫酸銨二次純化沉淀9’5560.00.4790.30862,850.127.32300.0乙醇沉淀9’’5560.00.4330.31470,314.027.32570.0透析硫酸銨+乙醇編號吸光度值稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值濃度（ug/ml)測得蛋白質(zhì)濃度(ug/ml)體積(ml)蛋白質(zhì)（酶）含量(mg)乙醇+硫酸銨10.67650016.918455.020.00169.1粗提5’0.76250019.119555.010.0095.6乙醇沉淀6'0.63350018.289140.012.50114.3硫酸銨一次純化上清8'0.1735004.062030.010.0020.3硫酸銨二次純化沉淀編號稀釋倍數(shù)待測管吸光度對照管吸光度絡(luò)氨酸標(biāo)準(zhǔn)液酶活(u)蛋白質(zhì)（酶）含量(mg)酶比活(u/mg)乙醇+硫酸銨1100001.3480.3280.57968911.9169.1410.0粗提5’50000.2840.20139421.495.6410.0乙醇沉淀6’69400.5330.43231643.5114.3280.0硫酸銨一次純化上清8’73000.4370.39720,737.520.31020.0硫酸銨二次純化沉淀8’’73000.4380.38240,954.520.32020.0透析乙醇+硫酸銨SDS電泳

樣品處理每孔點(diǎn)樣量20μl。取酶液15μl于1.5EP管，加5μl上樣緩沖液，至沸水中煮沸10min，冷卻后可點(diǎn)樣。電泳開始用80V恒壓電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠界面后改用120V繼續(xù)電泳，至可見的藍(lán)色染液條帶已接近膠板底部約1-2cm處停止電泳，總用時(shí)約1.5h。脫色關(guān)閉電源取下膠，放在染色液中染色30min左右，再放入脫色液中脫色(不斷換脫色液)至可以清楚的看到條帶為止。跑膠結(jié)果1：酶液1（粗提）；硫酸銨+乙醇4’:酶液4’（硫酸銨沉淀）；9’:酶液9’(乙醇沉淀)；9’’:9’透析過后乙醇+硫酸銨5’:酶液5’(乙醇沉淀);8’:酶液8’(硫酸銨沉淀)；8’’:8’透析過后結(jié)論及分析基于本實(shí)驗(yàn)硫酸銨+乙醇相比較而言更好，提出的酶比活更高硫酸銨對酶的活性可能存在抑制酶保護(hù)劑、硫酸銨和乙醇的條件選擇、離心轉(zhuǎn)速、反應(yīng)時(shí)間、PH等多種因素均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。蛋白質(zhì)含量（mg）酶活（u）酶比活