第五章 蛋白質(zhì)二

第五章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。Protein講授提綱蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(重點(diǎn)與難點(diǎn)）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（重點(diǎn)與難點(diǎn)）

第五節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)的含義蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目；多肽鏈的氨基酸順序；以及多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。

1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法直接進(jìn)行氨基酸定序（桑格）由cDNA序列反推氨基酸序列。FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT樣品必需純（>97%以上）；知道蛋白質(zhì)的分子量；知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。2、測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求

3、蛋白質(zhì)測(cè)序的策略

P168（1）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；（2）拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈；（3）斷裂鏈內(nèi)二硫鍵；（4）分析多肽鏈的N末端和C末端；（5）測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成；（6）多肽鏈部分裂解成肽段；（7）測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序；（8）確定肽段在多肽鏈中的順序；（9）確定多肽鏈中二硫鍵的位置。4、測(cè)定步驟(1)多肽鏈的拆分由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4、測(cè)定步驟(1)多肽鏈的拆分幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基);如果多肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的,如胰島素(兩條多肽鏈),可通過?蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4、測(cè)定步驟(2)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4、測(cè)定步驟(3)二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4、測(cè)定步驟可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定1應(yīng)用烷基化試劑保護(hù)巰基巰基（-SH）的保護(hù)(4)分析每條多肽鏈的氨基酸組成蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4、測(cè)定步驟(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端基氨基酸測(cè)定Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。末端基氨基酸測(cè)定二硝基氟苯（DNFB）法在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。末端基氨基酸測(cè)定丹磺酰氯法此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。末端基氨基酸測(cè)定肼解法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最快。末端基氨基酸測(cè)定

氨肽酶法羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。末端基氨基酸測(cè)定羧肽酶法4、測(cè)定步驟(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶。多肽鏈的選擇性降解Trypsin：R1=賴氨酸Lys和精氨酸Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）R1=Phe,Trp,Tyr肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶Pepsin：R1和R2或R1=Phe,Trp,Tyr,Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快;專一性差,切點(diǎn)多,最適pH值為2,二硫鍵穩(wěn)定,常用于確定二硫鍵的位置肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶(Thermolysin)：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。肽鏈水解位點(diǎn)嗜熱菌蛋白酶分別從肽鏈羧基端和氨基端水解肽鏈水解位點(diǎn)羧肽酶和氨肽酶化學(xué)法：(Cyanogenbromide)溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。多肽鏈的選擇性降解4、測(cè)定步驟(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定Edman

（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。Edman氨基酸順序分析法4、測(cè)定步驟(8)確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4、測(cè)定步驟(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定胃蛋白酶處理多肽鏈（肽段的混合物）。對(duì)角線電泳：把混合肽段點(diǎn)到濾紙中央，pH值6.5下，電泳，分離開；用過甲酸蒸氣處理后，斷開二硫鍵（磺基丙氨酸的肽），濾紙旋轉(zhuǎn)90度，再電泳，大多數(shù)肽段位于濾紙的一條對(duì)角線上，含磺基丙氨酸的肽偏離對(duì)角線，將這樣的肽段取下，進(jìn)行組成及順序分析。然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。二硫鍵位置的確定二硫鍵位置的確定對(duì)角線電泳練習(xí)題有一小肽A，Ⅰ用酸水解后分析氨基酸組成為Lys，His，Asp，2Glu，Ala，Val，Tyr；ⅡA肽與DNFB試劑反應(yīng)后得到DNP-Asp；Ⅲ

當(dāng)用羧肽酶處理后得游離Val；Ⅳ

將A肽用胰蛋白酶降解得2種肽，其一氨基酸組成為（Lys，Asp，Glu，Ala，Tyr），另一種氨基酸組成為（His，Glu，Val）可給出

DNP-His；Ⅴ糜蛋白酶降解得2種肽（Asp，Ala，Tyr），（Lys，His，2Glu，Val），問該A肽的氨基酸順序如何？解：由Ⅱ

Ⅲ得：

Asp-（…..)-Val由ⅠⅣ得:

Asp-(

Glu,Ala,Tyr)-Lys-His-Glu-Val由Ⅴ得:Asp-

Ala-Tyr所以,該A肽的順序?yàn)?Asp-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Glu-Val練習(xí)題2有一小肽A，Ⅰ用酸水解后分析氨基酸組成為Lys，His，Asp，2Glu，Ala，Val，Tyr,

2(NH3)；ⅡA肽與DNFB試劑反應(yīng)后得到DNP-Asp；Ⅲ

當(dāng)用羧肽酶處理后得游離Val；Ⅳ

將A肽用胰蛋白酶降解得2種肽，其一氨基酸組成為（Lys，Asp，Glu，Ala，Tyr）pH為6.4時(shí)凈電荷為零，另一種氨基酸組成為（His，Glu，Val）可給出DNP-His,pH為6.4時(shí)帶正電荷；Ⅴ糜蛋白酶降解得2種肽（Asp，Ala，Tyr）pH為6.4時(shí)凈電荷為零，（Lys，His，2Glu，Val）pH為6.4時(shí)帶正電荷，問該A肽的氨基酸順序如何？

Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val二、蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)（一）多肽的結(jié)構(gòu)一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

肽鍵肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。四肽的結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)示例1、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級(jí)(Secondary)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角。鮑林—探索真理堅(jiān)持正義的人在化學(xué)多個(gè)領(lǐng)域做出了重大貢獻(xiàn)。中學(xué)時(shí)，開了一所化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，名片上表明自己是化學(xué)家，大學(xué)時(shí)勤工儉學(xué)維持學(xué)習(xí)和生活。他花費(fèi)了大量精力研究生物大分子，特別是蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象，成為分子生物學(xué)的奠基人。1955年，與世界知名的大科學(xué)家愛因斯坦等，簽署了《科學(xué)家反對(duì)核試驗(yàn)宣言》。對(duì)和平事業(yè)的貢獻(xiàn)，榮獲1962年諾貝爾和平獎(jiǎng)。（1）-螺旋

-helix在-螺旋中肽平面的鍵長和鍵角一定；肽鍵的原子排列呈反式構(gòu)型；相鄰的肽平面構(gòu)成兩面角；多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離為0.15nm;肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺基團(tuán)的-CO基與第四個(gè)氨基酸殘基酰胺基團(tuán)的-NH基形成氫鍵。蛋白質(zhì)分子為右手-螺旋。-螺旋多肽主鏈按右手或左手方向盤繞，形成右手螺旋或左手螺旋，右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定。-螺旋典型α螺旋的特征①二面角：Φ=-57,Ψ=-48，是右手螺旋；②每圈螺旋：3.6個(gè)a.a殘基，高度：0.54nm；③每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100，沿軸上升0.15nm；④氨基酸殘基側(cè)鏈向外；⑤相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行；⑥肽鍵上C=O氧與它后面（C端）第四個(gè)殘基上的N-H氫間形成氫鍵。典型的α螺旋用3.613表示：3.6表示每圈螺旋包括3.6個(gè)殘基；13表示氫鍵封閉的環(huán)包括13個(gè)原子(P207)。

R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響

①多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸殘基,(如Lys，或Asp,或Glu)，不能形成穩(wěn)定的α-螺旋,如多聚Lys、多聚Glu；②Gly由于側(cè)鏈只是一個(gè)氫原子，繞a-碳的旋轉(zhuǎn)自由度更大,反而不易形成α-螺旋,開始或終止；R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響③R基大（如Ile）不易形成α-螺旋；④脯氨酸中止α-螺旋(剛性的環(huán)狀的側(cè)鏈,酰氨氮上缺少氫原子)；⑤R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。pH對(duì)α—螺旋的影響角蛋白（Keratin）角蛋白廣泛存在于動(dòng)物的皮膚及皮膚的衍生物，如毛發(fā)、甲、角、鱗和羽等，屬于結(jié)構(gòu)蛋白。角蛋白中主要的是-角蛋白。-角蛋白幾乎都是由-螺旋組成的纖維蛋白。-角蛋白的伸縮性能很好，當(dāng)-角蛋白被過度-拉伸時(shí)，則氫鍵被破壞而不能復(fù)原。此時(shí)-角蛋白轉(zhuǎn)變成-折疊結(jié)構(gòu)，稱為-角蛋白。毛發(fā)的結(jié)構(gòu)帶有許多二硫鍵的角蛋白,例如指甲的角蛋白很硬,而含有少量二硫鍵的角蛋白就很容易彎曲,例如毛發(fā)。角蛋白分子中的二硫鍵卷發(fā)(燙發(fā))的生物化學(xué)基礎(chǔ)永久性卷發(fā)(燙發(fā))是一項(xiàng)生物化學(xué)工程(Biochemicalengineering)。打開二硫鍵,-角蛋白在濕熱條件下可以伸展轉(zhuǎn)變?yōu)?構(gòu)象，但在冷卻干燥時(shí)又可自發(fā)地恢復(fù)原狀。形成新的錯(cuò)接的二硫鍵。

（2）-折疊(-pleatedsheet)

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm。-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。-折疊折疊

動(dòng)畫-角蛋白絲心蛋白(Fibroin)是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質(zhì)。絲心蛋白很柔軟,因?yàn)槎逊e的折疊片只是靠側(cè)鏈之間的范德華力結(jié)合在一起的。絲蛋白的結(jié)構(gòu)絲蛋白是伸展的反向-折疊結(jié)構(gòu)。分子中不含-螺旋。絲蛋白的肽鏈通常是由多個(gè)六肽單元重復(fù)而成。這六肽的氨基酸順序?yàn)椋?/p>

-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-（3）-轉(zhuǎn)角(-turn)在-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成。彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。β轉(zhuǎn)角的特征

(非重復(fù)性結(jié)構(gòu))①由多肽鏈上4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成;②Gly

側(cè)鏈小，經(jīng)常出現(xiàn)在-turn中;③第一個(gè)AA殘基的C=O與第四個(gè)AA殘基的N-H形成氫鍵;④Pro

環(huán)狀側(cè)鏈，能迫使-turn

形成;⑤多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。超二級(jí)結(jié)構(gòu)

有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體。由若干個(gè)相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。3種基本的組合形式:aa

型,?a?

型,??一般以一個(gè)整體參與三維折疊,作為三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。結(jié)構(gòu)域（Domain）在二級(jí)結(jié)構(gòu)及超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊，組裝成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、近似球形的三維實(shí)體，這種相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)就稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位。較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域的。結(jié)構(gòu)域一般有１００－２００氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成所謂的鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)例如，脫氫酶類的多肽主鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是起催化作用的結(jié)構(gòu)域，兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口。模序（Motif)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成具有特殊功能的空間結(jié)構(gòu)。EF手：鈣結(jié)合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix結(jié)構(gòu)。鋅指：DNA結(jié)合蛋白中，2個(gè)His、2個(gè)Cys結(jié)合一個(gè)Zn。亮氨酸拉鏈：DNA結(jié)合蛋白中，由亮氨酸殘基之間的疏水相互作用形成的拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)。2、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

(TertiaryStructure)（1）三級(jí)結(jié)構(gòu)研究方法X射線衍射法。三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。（2）三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)具備三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)一般是球蛋白，許多在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的aa堿基在三級(jí)結(jié)構(gòu)上相距很近。疏水核，活性中心或功能部位，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象十分重要。親水集團(tuán)分布在表面，可溶。大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域。（3）穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力

P201離子鍵

生物大分子表面的帶電基團(tuán)可以與藥物或底物分子的帶電基團(tuán)形成離子鍵。這種鍵可以解離。氫鍵

氫鍵的形成：氫鍵是由兩個(gè)負(fù)電性原子對(duì)氫原子的靜電引力所形成，是一種特殊形式的偶極—偶極鍵。它是質(zhì)子給予體X-H和質(zhì)子接受體Y之間的一種特殊類型的相互作用。氫鍵的大?。簹滏I的鍵能比共價(jià)鍵弱，比范德華力強(qiáng)，鍵長比共價(jià)鍵短。氫鍵具有方向性與飽和性：X與Y排斥，位于H的兩側(cè)

X—H…Y（180）；H小，只能容納一個(gè)Y與其形成氫鍵。范德華力

這是一種普遍存在的作用力，是一個(gè)原子的原子核吸引另一個(gè)原子外圍電子所產(chǎn)生的作用力。它是一種比較弱的、非特異性的作用力。范德華力包括引力和排斥定向力：永久偶極間的靜電相互作用誘導(dǎo)力：永久偶極與誘導(dǎo)偶極色散力：瞬間偶極與瞬間誘導(dǎo)偶極（主要形式）疏水作用

疏水作用，水介質(zhì)中蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部高分子的蛋白質(zhì)可形成分子內(nèi)疏水鏈、疏水腔或疏水縫隙，可以穩(wěn)定生物大分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

3、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)(QuaternaryStructure)四級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)模型

P244兩個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)p245球狀蛋白

球狀蛋白是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，功能最多的一類蛋白質(zhì)。這類蛋白結(jié)構(gòu)緊密，分子的外層多為親水性殘基，能夠發(fā)生水化；內(nèi)部主要為疏水性氨基酸殘基。因此，許多球蛋白分子的表面是親水性的，而內(nèi)部則是疏水性的。典型的球蛋白是血紅蛋白。血紅蛋白是一種結(jié)合蛋白。血紅蛋白含有四條肽鏈，每一條肽鏈各與一個(gè)血紅素相連接。血紅素同肽鏈的連接是血紅素的Fe原子以配價(jià)鍵與肽鏈分子中的組氨酸咪唑基的氮原子相連。血紅蛋白血紅蛋白是脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞主要組成部分，它的主要功能是運(yùn)輸氧和二氧化碳。血紅蛋白中，血紅素Fe原子的第六配價(jià)鍵可以與不同的分子結(jié)合：無氧存在時(shí)，與水結(jié)合，生成去氧血紅蛋白(Hb)；有氧存在時(shí)，能夠與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白(HbO2)。血紅蛋白與氧的結(jié)合不牢固，容易離解。HbO2

的形成和離解受氧的分壓和pH等因素的影響，氧的分壓和pH較高時(shí)，有利于血紅蛋白與氧的結(jié)合，反之，則有利于離解。

血紅素血紅素在蛋白中的位置血紅蛋白的功能血紅蛋白除了運(yùn)輸氧和CO2外，還能夠?qū)ρ旱膒H起緩沖作用。因?yàn)镠bO2在釋放出一分子氧的同時(shí)，結(jié)合一個(gè)氫質(zhì)子。這樣就可以消除由于呼吸作用產(chǎn)生的CO2引起pH的降低。煤氣中毒的機(jī)制一氧化碳（CO）也能與血紅素Fe原子結(jié)合。由于CO與血紅蛋白結(jié)合的能力是O2的200倍，因此，人體吸入少量的CO即可完全抑制血紅蛋白與O2的結(jié)合，從而造成缺氧死亡。急救方法是盡快將病人轉(zhuǎn)移到富含O2的環(huán)境中（如新鮮空氣、純氧氣或高壓氧氣），使與血紅素結(jié)合的CO被O2置換出來。

蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵

一級(jí)結(jié)構(gòu)→二級(jí)結(jié)構(gòu)→超二級(jí)結(jié)構(gòu)→結(jié)構(gòu)域→三級(jí)結(jié)構(gòu)→亞基→四級(jí)結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵

a鹽鍵（離子鍵）b氫鍵c疏水相互作用力

d范德華力e二硫鍵f酯鍵氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級(jí)鍵；氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大；疏水相互作用力對(duì)維持三級(jí)結(jié)構(gòu)特別重要；鹽鍵數(shù)量??；二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定。離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用分子伴侶概念（p239）：幫助新生多肽鏈正確折疊的一類蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)形成后需要它來形成正確的結(jié)構(gòu)，就象生活中需要伴侶來完善自己一樣）。作用：可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合，防止錯(cuò)誤折疊；與錯(cuò)誤折疊的肽段結(jié)合，誘導(dǎo)其正確折疊；對(duì)蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的正確形成起重要作用。

4、低級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)（1）氨基酸序列規(guī)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)核糖核酸酶的變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)(P234）；

血紅蛋白的分子病。（2）

同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化

同源蛋白質(zhì)在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。同源蛋白質(zhì)①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）。②有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱可變殘基?？勺儦埢?個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長度相同或相近。

通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。

親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。

（3）細(xì)胞色素CP182

分子量：12500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母44（4）胰島素①有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys

不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。②其它可變氨基酸對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用。③豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。

第六節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的

突變(分子病)

1、分子?。夯蛲蛔円鸬哪硞€(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。

2、鐮刀形紅細(xì)胞貧血：鏈第6位的AA殘基由正常的Glu變成了疏水性的Val-6月，鐮刀本應(yīng)該是割谷子(谷氨酸)的，卻歇了(Val)，因此得了鐮刀形紅細(xì)胞貧血。?3、鐮刀形貧血病的發(fā)病機(jī)理

正常人血紅蛋白，β.N......Glu6

鐮刀型貧血

β.N......Val6

生理?xiàng)l件下電荷

Glu-Va10

親水疏水

導(dǎo)致血紅蛋白聚集成不溶性的纖維束，并引起紅細(xì)胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。

二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能1、肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

由一條多肽鏈（珠蛋白）和一個(gè)血紅素輔基組成的球狀分子，單結(jié)構(gòu)域。8段直的α-螺旋（A、B、C…H），拐彎處是由1—8個(gè)氨基酸組成的松散肽段（無規(guī)卷曲）。血紅素輔基，扁平狀，結(jié)合在肌紅蛋白疏水洞穴內(nèi)。2、功能

哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì)。4個(gè)Pro殘基各自處在一個(gè)拐彎處，另外4個(gè)是Ser、Thr、Asn、Ile。p2553、肌紅蛋白的氧合曲線

（解離平衡常數(shù)）氧飽和度,即氧合肌紅蛋白分子數(shù)占肌紅蛋白分子總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

Y=0.5時(shí)，肌紅蛋白的一半被飽和，PO2=K=P50=2torr解離常數(shù)K也稱為P50，即半飽和氧分壓。4、Hill曲線和Hill系數(shù)P257圖6-7Hill曲線Log[Y/(1-Y)]對(duì)Logp(O2)

作圖稱為Hill曲線。Log[Y/(1-Y)]=0時(shí)的斜率稱Hill系數(shù)（nH)是協(xié)同性程度的一種量度。肌紅蛋白的nH=1（二）血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能1、血紅蛋白的亞基組成

成人：HbA：α2β298%HbA2：

α2δ22%胎兒：

HbFα2γ2早期胚胎：

α2ε22、血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)▲接近于球體，4個(gè)亞基分別位于四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基有一個(gè)血紅素輔基?！痢ⅵ骆湹娜?jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的相似。

4個(gè)血紅素都位于EF螺旋間，暴露在分子表面3、氧結(jié)合引起Hb構(gòu)象變化Hb緊張態(tài)：未結(jié)合氧時(shí)，a1與?1、a2與?2呈對(duì)角排列，結(jié)構(gòu)緊密，稱緊張態(tài)（Tensestate，T態(tài)），Hb與氧的親和力小。Hb松弛態(tài)：隨著與氧氣的結(jié)合，4個(gè)亞基間的鹽鍵斷裂，二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化，Hb變得松弛，稱為松弛態(tài)（Relaxedstate，R態(tài)），最后4個(gè)亞基全處于R態(tài)。去氧血紅蛋白中各亞基之間的鹽橋(離子對(duì))

3、氧結(jié)合引起Hb構(gòu)象變化協(xié)同效應(yīng)：指一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一亞基與配體的結(jié)合能力，如果是促進(jìn)作用，則稱為正協(xié)同效應(yīng)；反之，則為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。別構(gòu)效應(yīng)：一個(gè)蛋白質(zhì)與它的配體（或其它蛋白質(zhì)）結(jié)合后，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，使它更適于功能需要，這一類變化稱為變構(gòu)效應(yīng)。別構(gòu)是指含有2個(gè)以上配體結(jié)合部位。

4、血紅蛋白的氧合曲線四個(gè)亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)。因此，它的氧合曲線是S型曲線。血紅蛋白P50=26torr肺泡氧壓：Po2=100torr

，Y=0.97肌肉毛細(xì)血管：Po2=20torr，Y=0.25釋放氧：△Y=0.97—0.25=0.72肌紅蛋白（無協(xié)同效應(yīng)）：△Y不足0.1協(xié)同效應(yīng)可增加血紅蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地輸送氧氣。nH=1,無協(xié)同性nH＞1,正協(xié)同性nH＜1,負(fù)協(xié)同性p2625、波耳效應(yīng)及其生理意義

血紅蛋白上有CO2和BPG結(jié)合部位，因此，血紅蛋白還能運(yùn)輸CO2

。波耳效應(yīng)：增加CO2的濃度、降低pH能顯著提高血紅蛋白亞基間的協(xié)同效應(yīng)，降低血紅蛋白對(duì)O2的親和力，促進(jìn)O2的釋放，反之，高濃度的O2也能促使血紅蛋白釋放H+

和CO2

。

原因：H+

和CO2

穩(wěn)定T構(gòu)象。

P264圖6-17pH對(duì)血紅蛋白氧合的影響6、BPG的別構(gòu)效應(yīng)

BPG是血紅蛋白的負(fù)效應(yīng)物。

BPG（2,3-二磷酸甘油酸