第六章 發(fā)酵途徑

微生物生理學

王志生工樓203angzhi1002@126.com第六章2PyruvateAcetoin發(fā)酵（fermentation）發(fā)酵和無氧呼吸發(fā)酵和不完全氧化從丙酮酸開始的幾種發(fā)酵乙酰乳酸合成酶aPy氧還蛋白氧化還原酶酒精發(fā)酵A．酵母菌的酒精發(fā)酵Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型B．細菌的酒精發(fā)酵GA．酵母菌的酒精發(fā)酵—I型2CO22ATP2ADP2乙醇2乙醛2Pyr2PEPH2O2NAD+2NADH2ADP2ATP2ATP2ADP

二磷酸 果糖3-磷酸甘油醛2（二磷酸甘油酸）2（3-磷酸甘油酸）2（2-磷酸甘油酸）磷酸二羥丙酮I型正常條件下C6H12O6+2(ADP+Pi)丙酮酸脫羧酶2CH3CH2OH+2CO2+2ATP

乙醇脫氫酶A.II型(甘油發(fā)酵):加入亞適量的NaHSO3

SO3NaCH3CHO+NaHSO3

CH3CHOH磺化羥基乙醛油酯酶CH2OHCH2OHα-磷酸甘CH2OHC=OCH2O-PiCHOHCH2O-PiCHOHCH2OH+PiC6H12O6+NaHSO3

C3H8O3+C2H4OHSO3Na+CO2NADHNADDHAPA．II型(甘油發(fā)酵):加入亞適量的NaHSO3NaHSO3CO2ATPADP磺化羥基乙醛乙醛PyrPEPH2OADPATP2ATP2ADP3-磷酸甘油醛二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸G二磷酸果糖

NAD+磷酸二羥丙酮NADH

α-甘油磷酸Pi甘油α-磷酸CH2OHCH2OH甘油酯酶CH2OHC=OCH2O-PiCHOHCH2O-PiCHOHCH2OH+PiC6H12O6+NaHSO3

C3H8O3+C2H4OHSO3Na+CO2德國科學家CarlNeuberg和酵母菌II型酒精發(fā)酵

第一次世界大戰(zhàn)甘油硝酸甘油炸藥釀造廠1000噸甘油/月 耐鹽藻類B.III型(甘油發(fā)酵)堿性條件,pH7.6CH3CHO發(fā)生歧化反應:2CH3CHOCH3COOH+CH3CH2OHIII型(甘油發(fā)酵)堿性條件,pH7.60.5乙醇CO2ATPADPNADHNAD+乙醛PyrPEP0.5乙酸ADPATPH2O2ATP2ADP3-磷酸甘油醛二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸G二磷酸果糖

NAD+磷酸二羥丙酮NADH

α-甘油磷酸Pi甘油III型(甘油發(fā)酵)

CH3CHO發(fā)生歧化反應:堿性條件,pH7.62CH3CHOCH3COOH+CH3CH2OH反應方程式:

2C6H12O6

2C3H8O3+CH3COOH+CH3CH2OH+2CO2酵母好氧條件下Py進入TCA循環(huán)不入乙醇途徑，因為氧化磷酸化與底物水平磷酸化競爭ADP并生成更多的ATP，若保持充足供氧，則繼續(xù)高速生長，實現(xiàn)高密度發(fā)酵。厭氧條件下，Py不進入TCA而去乙醇合成途徑。因無氧，只能通過EMP途徑功能，導致ATP生成量低，若保持細胞生長，只能通過EMP通量增大來滿足。巴斯德效應：發(fā)酵狀態(tài)酵母在通氧時糖耗下降、乙醇生產(chǎn)量降低；停止通氣糖耗和乙醇產(chǎn)率大幅提高的現(xiàn)象。原因：供氧，ETC氧化NADH，能量得率高（36/38molATP/molGlucose，而EMP途徑僅2molATP；氧充足條件是厭氧條件產(chǎn)能效率的18倍），細胞生長迅速，但是不用消耗那么多的Glucose即可滿足細胞生長代謝的需求，而且不用生成乙醇來氧化NADH，使乙醇生成效率下降甚至停止；反之，厭氧條件下，EMP途徑產(chǎn)能效率僅為好氧條件的1/18，即單位時間必須消耗18mol的Glucose才能達到好氧條件的產(chǎn)能/供能效率，所以糖耗速率是好養(yǎng)條件下的18倍，而且必須通過生成乙醇來氧化NADH，使得乙醇合成效率大幅度提高。當然，前提條件是：有氧q酵母代謝調(diào)控過程的研究進展很多學者已經(jīng)研究了釀酒酵母對不同氮源的吸收利用的途徑與機理，以及不同氮源相互之間的作用。酵母可以利用不同的氮源，但并不是每種氮源都可以很好地支持酵母的生長。氨、谷氨酞胺和天冬酞胺等為比較好的氮源，而在脯氨酸和尿素等中生長速率比較慢。酵母對一種氮源的利用首先要將其轉化為谷氨酸或谷氨酞胺，以它們作為氮的供體合成其它的含氮化合物。在谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合成酶的作用下谷氨酸或谷氨酰胺可以由氨作為氮的供體而直接合成。當谷氨酸作為氮源時，谷氨酞胺合成酶利用谷氨酸和從谷氨酸到a-酮戊二酸反應中生成的氨合成谷氨酞胺。氨、谷氨酸和谷氨酞胺之間的相互轉化被稱為氮的中間代謝途徑C(netarl

Nirtogen

Metbolism，CNR)

釀酒酵母發(fā)酵條件下關鍵代謝酶活性分析環(huán)境的變化會在細胞內(nèi)產(chǎn)生響應，包括基因水平、蛋白質(zhì)水平、酶活性水平，代謝系統(tǒng)自我調(diào)控以適應環(huán)境變化。相對于研究細胞內(nèi)個別化學反應的變化，對代謝體系本身所產(chǎn)生的系統(tǒng)而精細的調(diào)控的研究更重要。在不同的環(huán)境下，胞內(nèi)的酶系會作出系統(tǒng)的調(diào)整與響應。胞內(nèi)酶活性受到可逆結合的因子、共價修飾和酶濃度等因素的影響。在第一種情況下，酶上特定的位點被信號分子結合而抑制或者激活，產(chǎn)生構象的變化，該信號分子可能是該酶或其他酶所催化反應的底物或者產(chǎn)物，比如變構效應等。在共價修飾的情況下，酶的結構可以被其他酶所催化的反應來改變，比如磷酸化。mRNA轉錄的速率受到嚴格的控制，酶的活性很大程度直接反應在酶的濃度上。樣品制備

樣品在10000rpm，4度下離心10分鐘，收集細胞。用100mM

Tris一Hcl(pH7.0)溶液洗滌2次，溶液包含20mM的KCI，5mM的MnSO4和0.1mMEDAT，然后重新懸浮在同樣的溶液中(每15g濕細胞懸浮在50ml緩沖液中)。懸浮液置于冰槽中，在超聲波破碎儀中超聲波破碎1min。細胞碎片在10000rpm，4℃下離心分離，得到的粗細胞抽提液用來迅速測量酶活性或者保存在-20℃。酶活性檢測在可控溫度的分光光度計上進行。反應所需混合物加入到1cm光程的石英比色皿中，最后加入細胞抽提液或者底物達到總體積為1ml，并且啟動反應。在波長340nm下測量NADH，NADPH的變化。每單位酶活性定義為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)轉化1umol底物所需的酶。檢測原理NADPH與NADH的摩爾吸光系數(shù)一樣酶活性單位為：umol/minmgprotein，可由體積酶活算出體系總酶活，再除以體系總蛋白量。每升反應體系有多少酶活NADPH是輔酶，為什么我的反應體系中沒有加酶，只是加底物和NADPH，其OD值也在下降，這是為什么呢？我的反應體系體積200uL,NADPH的終溶度是0.5mMNADPH在自然狀態(tài)下容易被氧化分解，加入2-巰基乙醇是還原劑，可以減少氧化加PMSF是因為PMSF（苯甲基磺酰氟）是一種蛋白酶抑制劑，可以有效的抑制菌體裂解后的釋放出的絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶的活性。防止它們降解消化目標蛋白。需注意PMSF溶解于水溶液后自身會迅速降解，大約1小時會自身降解完畢即失去作用。需要每1小時補加一些新鮮的PMSF。加DTT是因為DTT（二硫蘇糖醇）是一種還原劑。發(fā)酵條件PYK趨勢相反，乙酸為碳源酶活性遠遠低于前兩者，因其不在EMP系統(tǒng)中。釀酒酵母ICDH以NADP為輔酶釀酒酵母在發(fā)酵不同階段和以乳酸為碳源下的

蛋白質(zhì)組解析和酶活性分析第一個樣品取在葡萄糖作碳源的對數(shù)生長期，此時葡萄糖正在迅速地被消耗，同時主要積累了乙醇等代謝產(chǎn)物。在發(fā)酵的后期，葡萄糖被

消耗光，菌體調(diào)整了體內(nèi)的酶系，轉而利用乙醇產(chǎn)生了二次生長的現(xiàn)象。在第10

個小時取得的樣品就代表了酵母開始利用發(fā)酵前期積累的乙醇為碳源的情況。說明乙醇為碳源的基本培養(yǎng)基中利用釀酒酵母表達外源基因時所表現(xiàn)出來的優(yōu)良的性態(tài)。在葡萄糖作為碳源的對數(shù)期，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（zwf）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)的表達量遠遠高于另外兩個樣品。這也與酶活性檢測的結果相一致(G6PHD)(圖3.3)圖3.5的結果表明此時丙酮酸激酶的酶活性測量結果比另兩種情況高很多，表明在利用葡萄糖為碳源時相對于利用乙醇和乳酸時，糖酵解途徑要更活躍。這種趨勢在磷酸戊糖途徑的氧化階段尤為明顯。由glk和pgi基因所分別表達的葡萄糖激酶和磷酸葡萄糖異構酶是催化糖酵解中前兩步，由葡萄糖轉化成6-磷酸葡萄糖和由6-磷酸葡萄糖轉化成6-磷酸果糖的反應。從圖3.10(a)中可以看出，在葡萄糖作碳源的對數(shù)期時，為了有效地利用葡萄糖，表現(xiàn)了較高的表達量，相應地在葡萄糖消耗光的后期和乳酸作碳源時表達量較低或未被檢測到。由pgk、eno、pyk所分別編碼的磷酸甘油酸激酶（3-磷酸甘油酸激酶催化1，3-二磷酸甘油酸轉變3-磷酸甘油酸，產(chǎn)生1分子ATP），烯醇酶和丙酮酸激酶也都在以葡萄糖為碳源時顯示出較高的表達量。在葡萄糖作為碳源的對數(shù)期，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（zwf）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)的表達量遠遠高于另外兩個樣品。同時在三個條件下磷酸戊糖途徑的非氧化階段卻無如此明顯的差別，相關的蛋白質(zhì)包括轉醛酶(tall)、轉酮酶(tkl1，tkl2)。以上結果表明，在利用乙醇和乳酸為碳源時，糖酵解途徑并不活躍，磷酸戊糖途徑的氧化階段也被大大地削弱或被阻斷了。而作為NDA、NRA、色氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸等生物合成前體的4-磷酸赤醉糖和5-磷酸核糖主要由磷酸戊糖途徑的非氧化階段來提供。圖3.10(a)的結果還表明，對于fba和tdh3編碼的1，6-二磷酸果糖醛縮酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶由于其催化可逆的反應，既屬于糖酵解途徑，又對糖異生有貢獻，同時提供了磷酸戊糖途徑的非氧化階段的反應物，所以在利用乙醇和乳酸時，也表現(xiàn)出了較高的表達量。稀釋率的倒數(shù)等于保留時間可以看出在葡萄糖和甘油作為碳源時，菌體生物量得率幾乎相同，而在乙酸作為碳源時生物量得率相對較低，同時CO2生成速率和02攝入速率較高，表明在這種條件下呼吸作用可能較為旺盛。PEP羧激酶催化的由OAA生成PEP的反應更是沒有激活甘油作為碳源連續(xù)培養(yǎng)中中間代謝途徑的代謝通量分布OAA到PEP占到碳流量的21%乙醛酸循環(huán)碳流占28.8%總結ED途徑中，Py的羧基來自G的C1與C4磷酸葡萄糖酸脫水酶?同型乳酸發(fā)酵相關酶活性增大以維持胞內(nèi)相對穩(wěn)定的pH，有穩(wěn)定生長的作用Why？磷酸解酮酶途徑(Phosphoketolase

Pathway)

Glucose

Lactate、Ethanol、CO2腸膜明串珠菌雙歧桿菌它們存在微量的醛縮酶、G-6-P脫氫酶活性基本不具備完整的EMP、HMP和ED途徑磷酸戊糖解酮酶異型乳酸發(fā)酵戊糖磷酸解酮酶途徑(PK途徑)(PentosePhosphoketolasePathway):戊糖→木酮糖-5-P解酮→2C,3C磷酸轉乙酰酶乙醛脫氫酶，指其逆反應乙醇脫氫酶，指其逆反應腸膜明串珠菌中，磷酸酮糖解酮酶5-磷酸核酮糖5-磷酸木酮糖①分解1分子葡萄糖只產(chǎn)生2分子ATP比EMP途徑少一個②幾乎產(chǎn)生等量的乳酸、乙醇和CO2異型乳酸發(fā)酵乳酸發(fā)酵磷酸己糖解酮（HK）途徑

2葡萄糖

2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖6-磷酸-果糖4-磷酸-赤蘚糖乙酰磷酸2木酮糖-5-磷酸2甘油醛-3-磷酸2乙酰磷酸2乳酸2乙酸乙酸磷酸己糖解酮酶磷酸戊糖解酮酶戊逆HMP途徑同EMP乙酸激酶磷酸己糖酮解途徑的特點：

①有兩個磷酸酮解酶參加反應；②2分子葡萄糖分解為3分子乙酸和2分子3-磷酸-甘油醛，3-磷酸-甘油醛在脫氫酶的參與下轉變?yōu)镻y和乳酸生成5ATP雙歧桿菌中HK途徑

Py羧基來自G的C3C4PyC3來自G的C1C6有一半來自C6，該C沒有標記PK磷酸戊糖解酮酶途徑FBP積累引起GAP積累，而GAP還從PK途徑來，通過抑制6-P-G脫氫酶減少PK來水，同時增大LDH以加強下游排水，以維持FBP的相對穩(wěn)定；同時，6-P-G脫氫酶抑制會引起6-P-G積累，它會抑制磷酸己糖異構酶，這樣也使FBP下降并穩(wěn)定。主要生成乳酸，因B區(qū)域流量抑制了。FBP下降到一定程度，其對6-P-G脫氫酶抑制作用消失或減弱，B區(qū)域出現(xiàn)一定流量，等量GAP（其向左去生成乳酸）和乙醇生成；同時，6-P