第十六章-細(xì)胞的破碎

第十六章—細(xì)胞破碎

(CellDisruption)生

化

分

離

過(guò)

程

的

一

般

流

程發(fā)酵液細(xì)胞分離(離心，過(guò)濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過(guò)濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過(guò)濾、超過(guò)濾)濃縮(超過(guò)濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性√√3.1概述

胞外型：一些微生物在代謝過(guò)程中將產(chǎn)物分泌到細(xì)胞之外的液相中（稱胞外酶），這些產(chǎn)品主要為醫(yī)藥、保健產(chǎn)品和工業(yè)用。這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，提取過(guò)程只需直接采用過(guò)濾和離心進(jìn)行固－液分離，然后將獲得的澄清濾液再進(jìn)一步純化即可。其后續(xù)分離和純化都相對(duì)簡(jiǎn)單。

由于一些重組DNA（rDNA）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須在細(xì)胞內(nèi)組裝來(lái)獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時(shí)被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類rDNA產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，然后再進(jìn)行提純，為后續(xù)的分離純化做好準(zhǔn)備工作。概

述胞內(nèi)型：幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α--干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤

細(xì)胞破碎（cellrupture）技術(shù)是指利用外力（物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法）破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。概

述

微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜和它所包圍的細(xì)胞漿合稱原生質(zhì)體。動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來(lái)自于細(xì)胞壁。

基于遺傳和環(huán)境等因素，不同類型生化物質(zhì)其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。此外，不同的生化物質(zhì)其穩(wěn)定性有較大差別，在破碎過(guò)程中應(yīng)防止變性和被胞內(nèi)的酶水解，因此，破碎方法的選擇和操作條件的優(yōu)化是十分必要的。革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模式圖革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模式圖

3.2細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)（細(xì)菌肽聚糖結(jié)構(gòu)示意圖）

幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycanchain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。

破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。

☆陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2～3nm，占細(xì)胞壁成分的10％左右,由于肽聚糖之間僅由四肽側(cè)鏈直接連接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖居于細(xì)胞壁最內(nèi)層，緊貼在細(xì)胞膜上，在肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層(約8～10nm)，主要成分為脂蛋白、脂多糖和其它脂類，因此，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂類含量較高?！罡锾m氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，具有20～80nm的肽聚糖層，約占細(xì)胞壁成分的40～90％，此外細(xì)胞壁還含有大量磷壁酸。酵母菌酵母菌一般有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，特別是含有50%蛋白質(zhì)，很多B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時(shí)也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)。畜禽飼料(單細(xì)胞蛋白，SCP)食品添加劑（啤酒酵母）

細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生細(xì)胞壁之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚(4μm以上)，常有三層組成。在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。植物細(xì)胞細(xì)胞壁的化學(xué)組成組分結(jié)構(gòu)和分類纖維素β－1，4－D－葡聚糖半纖維素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖果膠物質(zhì)半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白各種酶類凝集素組織搗碎勻漿機(jī)3.3細(xì)胞壁的破碎3.3.1破碎率的評(píng)價(jià)式中：N0（原始細(xì)胞數(shù)）

N（經(jīng)t時(shí)間操作后保留下來(lái)的未損害的細(xì)胞數(shù)）(1)直接計(jì)數(shù)法直接對(duì)適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以通過(guò)平板計(jì)數(shù)技術(shù)或在血球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察來(lái)實(shí)現(xiàn)最終染色細(xì)胞的計(jì)數(shù)。(2)間接計(jì)數(shù)法

間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸浮液中細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。3.3.2細(xì)胞破碎的方法目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。(一)機(jī)械法①高速攪拌珠研磨破碎法（Finegrinding）②高壓勻漿破碎法（Homogenization）③超聲波破碎法（Ultrasonication）研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國(guó)西門子機(jī)械公司制造）。①高速攪拌珠研磨破碎法（Finegrinding）NetzschLM-20型珠磨機(jī)高速珠磨機(jī)工作原理水平位置的磨室內(nèi)放置玻離小珠，裝在同心軸上的圓盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動(dòng)，細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動(dòng)而引起。在料液出口處，旋轉(zhuǎn)圓盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，易造成某些生化物質(zhì)破壞，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。在珠磨法中，細(xì)胞的破碎率也能用一級(jí)速率方程式表示：ln[1/(1-R)]=KtK－破碎速率常數(shù)t－停留時(shí)間R－破碎率破碎速率常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如攪拌轉(zhuǎn)速、料液的循環(huán)流速、細(xì)胞懸浮液的濃度、玻璃小珠的裝置和珠體的直徑以及溫度等。

1.進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞濃度和負(fù)荷，料液的流速，攪拌器的轉(zhuǎn)速和構(gòu)型，以及溫度等。這些參數(shù)不僅影響破碎程度，也影響所需能量。

2.珠體的大小應(yīng)根據(jù)細(xì)胞大小和濃度以及在連續(xù)流動(dòng)的操作過(guò)程中不使珠體帶出來(lái)選擇。

3.珠體在磨室中的裝量影響破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌適宜的珠體裝量為80％，珠體量的增加使熱擴(kuò)散性能降低而引起溫度升高。

4.增加攪拌速度能提高破碎效率，但過(guò)高的速度反而會(huì)使破碎率降低，能量消耗增大，所以攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)適當(dāng)。②高壓勻漿破碎法操作原理:

原理：利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。

在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母菌等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。其破碎屬于一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，被破碎的細(xì)胞分率符合公式：

ln[1/(l－R)]＝KNPα其中R：破碎率；

K：與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；

P：操作壓力；

N：懸浮液通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)。

a：與微生物種類有關(guān)的常數(shù)；高壓勻漿法適用的范圍酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎。料液細(xì)胞濃度可達(dá)到20%左右。☆團(tuán)狀和系狀菌易造成高壓勻漿器的堵塞，不宜使用高壓勻漿法。高壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng)高壓勻漿器的操作溫度上升約２-３℃/10MPa為了保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需要對(duì)料液作冷卻處理。多組破碎操作中需要在級(jí)間設(shè)置冷卻裝置可有效防止溫度上升，保護(hù)產(chǎn)物活性。高壓勻漿器破碎細(xì)胞

升高壓力有利于破碎，它表明可以減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，在不明顯增加通過(guò)量的情況下，甚至一次通過(guò)勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過(guò)小，從而給隨后細(xì)胞碎片的分離工作帶來(lái)好處。Brokman等人已研究了能適應(yīng)于高壓操作的勻漿閥，試驗(yàn)表明在約175MPa的壓力下，破碎率可達(dá)100％，但是也有試驗(yàn)表明當(dāng)壓力超過(guò)一定的值后，破碎率增長(zhǎng)得很慢，在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55~70Mpa。③超聲波破碎法超聲波破碎超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-20kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液,是一種液相剪切破碎法。

超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。超聲波破碎的機(jī)理在相當(dāng)高的輸入聲能下，液體各個(gè)成核部位會(huì)形成許多小氣泡。在聲波膨脹相中，這些氣泡會(huì)增大，而在壓縮相中氣泡會(huì)被壓縮，直至不能再壓縮時(shí)，氣泡破裂，釋放出猛烈的震波。震波通過(guò)介質(zhì)傳播。在氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量聲能被轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度使細(xì)胞破碎。在液流中當(dāng)某點(diǎn)壓力低于液體所在溫度下的空氣分離壓時(shí)，原來(lái)溶于液體中的氣體會(huì)分離出來(lái)產(chǎn)生氣泡，這就叫空穴現(xiàn)象

。超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。超聲波破碎的有效能量利用率極低，操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。影響因素：7）細(xì)胞懸浮液的流速：取決于停留時(shí)間影響總收率。1）振幅：直接與聲能有關(guān)系。2）細(xì)胞懸浮液的黏度：影響能耗并會(huì)抑制空穴。3）表面張力：影響細(xì)胞破碎效率。4）被處理懸浮液的體積：體積大需要能量大。5）珠粒的體積和直徑：添加細(xì)小的珠粒（研磨）。6）探頭的形狀和材料：振幅與面積成反比。

超聲波清洗器(DL-720D)DL型系列超聲波清洗器除其本身具有高效，高質(zhì)量的清洗功能外，還具有“脫氣”、“提取”、“乳化”、“加速溶解”、“粉碎”、“分散”等多種功能。產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于各種需要清洗的物品。

SonicsVC750/VC500超聲波破碎儀適用于多種研究領(lǐng)域之多用途多功能的超聲破碎儀，它可處理由幾微升到多達(dá)幾百升的有機(jī)和無(wú)機(jī)樣品，能夠破碎各類細(xì)胞、細(xì)菌、孢子、組織，又可以打碎聚合物，乳化樣品，溶解難溶物質(zhì)，加速反應(yīng)，霧化液體，分散顆粒，制備樣品，氣化液體及清洗技術(shù)。機(jī)械法的缺點(diǎn)：需要高的能量并且產(chǎn)生高溫和高的剪切力，容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活。產(chǎn)物非專一，產(chǎn)生微粒尺寸范圍大，分離困難。二、非機(jī)械法①酶溶破碎法（enzymelysis）②化學(xué)破碎法（chemicaltreatment）③滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）④凍融破碎法（freezingandthawing）⑤干燥破碎法（drying

）其中酶法和化學(xué)法應(yīng)用最廣。物理法

①酶解酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。酶解法的優(yōu)點(diǎn)

能選擇性地釋放產(chǎn)物抽提的速率和收效高發(fā)生酶解的條件溫和不殘留細(xì)胞碎片但酶水解價(jià)格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣。

自溶作用

自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。改變其生長(zhǎng)環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。

②化學(xué)法

采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來(lái)。酸堿處理，調(diào)節(jié)pH，改變蛋白質(zhì)所帶電荷，物質(zhì)間作用力降低，蛋白質(zhì)溶解。合成的表面活性劑：SDS、TritonX-100和吐溫（Tween-80）等。（兩性化合物，在水中形成膠團(tuán)，將蛋白質(zhì)包在膠團(tuán)內(nèi)，而蛋白質(zhì)的親水基向水相，改變其通透性）有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。

（溶劑被細(xì)胞壁脂質(zhì)層吸收后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁膨脹，最后造成細(xì)胞壁的破裂）如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)?；瘜W(xué)法和酶法一樣也存在對(duì)產(chǎn)物的釋出選擇性好，細(xì)胞外形較完整，碎片少，核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離等優(yōu)點(diǎn)，故使用較多。但該法容易引起活性物質(zhì)失活破壞，因此，根據(jù)生化物質(zhì)的穩(wěn)定性來(lái)選擇合適的化學(xué)試劑和操作條件是非常重要的。另外，化學(xué)試劑的加入，常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難，并影響最終產(chǎn)物純度。如表面活性劑存在常會(huì)影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析，因此必須注意除去。③滲透壓沖擊法

滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂(此法對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌不適用)。④凍結(jié)-融化法

將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的