各產(chǎn)地金櫻子藥材的根和根莖免疫調(diào)節(jié)作用,免疫學(xué)論文

各產(chǎn)地金櫻子藥材的根和根莖免疫調(diào)節(jié)作用,免疫學(xué)論文金櫻根RosaLaevigataRadix又名金櫻蔃、脫骨丹，(中國(guó)藥典〕2018年版附錄收載金櫻根為薔薇科植物金櫻子RosalaevigataMichx.及同屬植物小果薔薇R.cymosaTratt.和粉團(tuán)薔薇R.multifloraThunb.varcathayensisRehd.etWils植物的枯燥根。金櫻子酸、澀、平，固精澀腸，用于滑精、遺尿、痢疾、泄瀉、崩漏帶下、子宮脫垂、痔瘡。臨床上金櫻子藥材常用于治療前列腺炎、婦科疾病、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷燙傷及部分炎癥性疾病等。在金櫻子藥材市場(chǎng)，時(shí)常將金櫻子藥材的根莖混入金櫻根中。而由于根莖與根混用及不同品種入藥等，經(jīng)常限制了金櫻根在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)就廣西、云南、貴州3個(gè)不同產(chǎn)地金櫻子藥材的根和根莖2個(gè)藥用部位的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了比擬，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用此藥材提供一定的藥理學(xué)根據(jù)，保證金櫻子藥用植物資源的可持續(xù)發(fā)展。1、材料1.1樣品3個(gè)產(chǎn)地〔廣西、貴州、云南〕金櫻子RosalaevigataMichx.的根和根莖樣品共6種，均由桂林三金藥業(yè)股份有限公司高級(jí)工程師鐘小清鑒定并提供。將以上3個(gè)不同產(chǎn)地的金櫻子的根和根莖分別常規(guī)水提，提取2次，合并提取液，濃縮，噴霧枯燥即得。樣品主要信息見(jiàn)表1。臨用前稱取所需藥量，采用無(wú)菌蒸餾水溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?.2陽(yáng)性藥注射用環(huán)磷酰胺〔CTX〕，0.2g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)11122332；陽(yáng)性藥物配制方式方法：臨用前稱取所需藥量，采用0.5%羧甲基纖維素鈉研磨混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?.3動(dòng)物ICR小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量18～22g，雄性，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK〔蘇〕2008-0010。小鼠均飼養(yǎng)于獨(dú)立送風(fēng)籠具〔IVC〕中，空氣干凈度萬(wàn)級(jí)，實(shí)驗(yàn)室溫度〔242〕℃；相對(duì)濕度60%～80%；空氣交換次數(shù)為10～15次/h；光照周期：12h〔日〕/12h〔夜〕。分開(kāi)飼養(yǎng)，每籠不超過(guò)5只。飼料為鼠全價(jià)顆粒飼料，購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。墊料為滅菌顆粒墊料，購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。飲水為飲用純化水。1.4主要試劑0.9%氯化鈉注射液，南京小營(yíng)制藥廠，批號(hào)2020020602；印度墨水，北京篤信精細(xì)制劑廠，批號(hào)0051024；無(wú)水碳酸鈉〔Na2CO3〕，上海虹光化工廠，批號(hào)100412；氰化高鐵血紅蛋白試劑，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)20200303；新鮮綿羊紅細(xì)胞，由南京市綿羊血供給站提供；2,4-二硝基氟苯〔DNFB〕，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，湖北武漢福鑫化工有限公司，批號(hào)202012001；丙酮，南京化學(xué)試劑廠，批號(hào)202003030；其余試劑均為市售分析純。1.5主要儀器BSA124S精致細(xì)密電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；KD160型電子秤，東莞百利達(dá)健康器材有限公司；Safire多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。2、方式方法與結(jié)果2.1劑量的設(shè)置金櫻子的臨床最大用量為每人60g/d，人體質(zhì)量按60kg計(jì)，受試藥物高、中、低劑量按體外表積折算，分別約相當(dāng)于人臨床劑量的2.0、1.0、0.5倍。2.2對(duì)正常小鼠遲發(fā)性超敏反響的影響2.2.1分組與給藥200只小鼠隨機(jī)分為20組，每組10只：對(duì)照組、CTX〔0.1g/kg〕陽(yáng)性對(duì)照組和GX-J、GX-G、GZ-J、GZ-G、YN-J、YN-G6個(gè)樣品組，6個(gè)樣品均設(shè)高、中、低劑量〔18.0、9.0、4.5g/kg〕。每組配制不同濃度，給藥體積均為20mL/kg，各組動(dòng)物連續(xù)ig給藥7d，CTX隔日給藥，其他天天1次。2.2.2免疫方式方法上述各組動(dòng)物給藥的第3天，每鼠用手術(shù)剪腹部去毛，范圍約3cm3cm，將1%DNFB溶液50L均勻涂抹致敏。末次給藥后，將1%DNFB溶液用移液器汲取10L均勻涂抹于小鼠左耳兩面進(jìn)行攻擊，24h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm的耳片稱質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量之差為腫脹度。2.2.3結(jié)果與對(duì)照組相比，金櫻子藥材樣品對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反響均表現(xiàn)為抑制作用，華而不實(shí)YN-G、GX-G和GZ-G3個(gè)樣品抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，見(jiàn)表2。2.3對(duì)正常小鼠體液免疫功能的影響2.3.1分組與給藥200只小鼠隨機(jī)分為20組，每組10只。分組及給藥方案同2.2.1項(xiàng)方式方法。2.3.2免疫方式方法給藥開(kāi)場(chǎng)和結(jié)束分別測(cè)定體質(zhì)量1次。給藥的第3天，每只ip20%綿羊紅細(xì)胞懸液0.2mL。末次給藥后24h摘除小鼠眼球取血，室溫放置1h，2000r/min離心20min，取上層血清，同組10只混合，用生理鹽水進(jìn)行800倍稀釋，然后分別取出1mL依次放入試管中，每管參加0.5mL5%綿羊紅細(xì)胞懸液及1mL1∶10稀釋的豚鼠血清，將反響管搖勻后移至37℃恒溫水浴中保溫1h，期間輕輕振搖1次，反響畢，立即移入冰浴中，終止反響。將反響管以2000r/min離心20min后取上清液1mL參加3mL氰化高鐵血紅蛋白試劑，搖勻，放置10min，在紫外可見(jiàn)分光光度儀上以540nm比色。另設(shè)不加補(bǔ)體而以生理鹽水代替的空白對(duì)照管，其他操作均一樣。取0.25mL5%綿羊紅細(xì)胞懸液，用氰化高鐵血紅蛋白試劑稀釋至4mL，搖勻，放置10min后540nm比色。計(jì)算樣品半數(shù)溶血值〔HC50〕。2.3.3結(jié)果與對(duì)照組相比，金櫻子藥材樣品對(duì)小鼠體液免疫〔溶血素抗體生成〕均表現(xiàn)為明顯的抑制作用，各組劑量依靠性不明顯，各產(chǎn)地根樣品的抑制作用略強(qiáng)于根莖樣品，見(jiàn)表3。2.4非特異性免疫功能對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)〔RES〕吞噬功能的影響2.4.1分組與給藥200只小鼠隨機(jī)分為20組，每組10只。分組及給藥方案同2.2.1項(xiàng)方式方法。2.4.2免疫方式方法于末次給藥后24h，尾iv印度墨水〔1∶3〕10L/g，于注入墨水后2min及10min時(shí)用毛細(xì)管從小鼠眼眶后靜脈叢取血，用5～40L精致細(xì)密移液器汲取20L血，立即吹入0.1%Na2CO3溶液2mL中，于680nm處比色，于10min采血后立即處死小鼠，并取肝、脾、胸腺稱質(zhì)量，按下式計(jì)算廓清指數(shù)〔K〕、吞噬系數(shù)〔〕值、肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。A2和A10表示2和10min血樣的吸光度值2.4.3結(jié)果與對(duì)照組相比，金櫻子藥材各樣品對(duì)RES吞噬功能均無(wú)明顯影響，見(jiàn)表4。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS19軟件的一般線性模型，將設(shè)計(jì)的模型、給藥劑量、植物的用藥部位以及藥物的產(chǎn)地4個(gè)因素對(duì)藥效的影響進(jìn)行了多因素方差分析。結(jié)果表示清楚，模型因素和劑量因素F檢驗(yàn)的P＜0.001；用藥部位因素F檢驗(yàn)的P值為0.0007；地區(qū)因素F檢驗(yàn)的P值為0.5249，遠(yuǎn)大于0.05，且擬合優(yōu)度R2＝0.9955。由此推斷，在顯著水平P＝0.05的條件下，模型的設(shè)計(jì)、給藥劑量以及植物的用藥部位對(duì)藥效影響非常顯著，而藥物產(chǎn)地的影響較小。進(jìn)一步，采用FishersLSD多重檢驗(yàn)考察了來(lái)源于植物不同部位的藥物作用的差異。結(jié)果表示清楚，金櫻子根莖和根的藥物作用無(wú)顯著性差異〔P＞0.05〕。3、討論金櫻子的研究主要集中在臨床應(yīng)用方面，它已被制成多種劑型廣泛應(yīng)用于臨床，如婦科千金片、金雞膠囊、王老吉涼茶等，但對(duì)其的化學(xué)成分、鑒別方式方法和藥理作用的研究報(bào)道鮮為少見(jiàn)，這對(duì)充分開(kāi)發(fā)利用金櫻子極為不利。經(jīng)調(diào)查，金櫻子臨床應(yīng)用情況混亂，存在金櫻子根莖與根混用及不同品種入藥現(xiàn)象等。臨床應(yīng)用證實(shí)金櫻根對(duì)婦科炎癥和男性前列腺炎具有較好的療效，此類疾病的發(fā)作除了各種病菌感染的因素之外，機(jī)體免疫功能的失衡也是發(fā)病的主要因素之一，尤其是一些非感染性炎癥的發(fā)病機(jī)制更多是由于免疫因素所致。這提示金櫻根在免疫調(diào)節(jié)方面可能具有一定成效，而此方面的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中選擇3種體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，分別考察金櫻根藥材樣品對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫系統(tǒng)的影響，結(jié)果顯示金櫻子對(duì)于前2種特異性免疫反響具有較明顯的抑制作用，但對(duì)非特異性免疫反響作用不明顯。藥效學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，金櫻子不同藥用部位〔根和根莖〕和不同產(chǎn)地〔廣西、貴州、云南〕的受試樣品在免疫活性調(diào)節(jié)方面的作用基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。本實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了不同部位和不同產(chǎn)地金櫻子藥材樣品的免疫調(diào)節(jié)活性，明確了其具有一定的特異性免疫抑制活性，同時(shí)也表示清楚不同來(lái)源的受試樣品在免疫活性調(diào)節(jié)方面的作用基本一致，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可為金櫻子藥材的開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)根據(jù)，有助于更廣泛的臨床應(yīng)用。以下為參考文獻(xiàn)：[1]廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].1990.[2]鐘小清,呂高榮,鄒節(jié)明.金櫻根藥材的名實(shí)考證[J].中草藥,2018,40(7):1140-1143.[3]譚年秀,郭巧玲,田素英,等.金櫻根的藥用歷史及當(dāng)代研究大概情況[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2018,6(12):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