干細(xì)胞與組織工程間充質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用

干細(xì)胞與組織工程間充質(zhì)干細(xì)胞及其應(yīng)用第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日間充質(zhì)干細(xì)胞與骨關(guān)節(jié)疾病一.概述二.間充質(zhì)干細(xì)胞的來源三.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性四.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化六.間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日一.概述何謂間充質(zhì)干細(xì)胞？

間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymalStemCell，

MSC）具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，具有向多種類型細(xì)胞分化的能力，可以分化為骨、軟骨、肌腱、脂肪、心臟、肝臟、神經(jīng)、上皮等多種細(xì)胞。由于能分化為多種中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞而得名。MSC應(yīng)用廣泛第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質(zhì)干細(xì)胞的來源骨髓來源的MSC肌肉來源的MSC

骨來源的MSC

軟骨來源的MSC

腱來源的MSC

脂肪來源的MSC

臍帶血來源的MSC

第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質(zhì)干細(xì)胞的來源

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨膜、松骨質(zhì)、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中。骨髓來源的MSC

僅占骨髓細(xì)胞的0.001‰～0.1‰

第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質(zhì)干細(xì)胞的來源骨髓來源的MSC第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日二.間充質(zhì)干細(xì)胞的來源臍帶血來源的MSC

第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性（一）MSC形態(tài)特征及生長特性第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性（二）MSC分化潛能

具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下不僅可分化為造血細(xì)胞，還具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日過氧化物酶體增殖激活受體-2第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性(三)

MSC的表面標(biāo)志及鑒定MSC沒有一個獨(dú)特的已知表面標(biāo)志物。

目前比較公認(rèn)的鑒定方法是：

MSC缺乏：造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34,CD45,CD11b

MSC表達(dá)：CD90，CD71，CD44第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性（四）MSC免疫學(xué)特性

1.MSC低免疫原性不表達(dá)MHC-II類分子和Fas-L;也不表達(dá)B7-1,B7-2…..

2.MSC具有免疫調(diào)節(jié)功能

通過細(xì)胞間的相互作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞的增殖及其免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫重建的功能。

正是由于間充質(zhì)干細(xì)胞所具備的上述免疫學(xué)特性:

*

MSC在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

*通過自體移植MSC可以重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能，并且可避免免疫排斥反應(yīng)。

第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日三.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性（五）MSC具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性。

第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日四.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的分離1.貼壁分離法（全骨髓法或一步法）：例：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離1)取4~6周齡正常昆明鼠2只的股骨和脛骨，用PBS洗凈，去掉干骺端2)用1ml無菌注射器，吸取1ml含9%FBS的RPMI-1640，12μM的L-谷氨酰胺、1%青霉素和1%鏈霉素的篩選培養(yǎng)基（CIM），沖出骨髓

第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的分離

1.貼壁分離法：

3)將骨髓吹打均勻后，靜置5分鐘，以2×106/ml接種到25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).4）24~48h后，換液，棄去未貼壁細(xì)胞，PBS洗3次，每3~4天換一次液.

5）待細(xì)胞90%融合后傳代（大約10~14天），用0.05%的胰酶和0.02%EDTA消化3分鐘，含血清的培養(yǎng)基終止消化，1000rpm，5min離心，收集細(xì)胞,1：2傳代。四.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的分離單純上述貼壁分離法難以獲得純的MSC。2.密度梯度離心法：

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)常用此法。根據(jù)各種骨髓細(xì)胞比重不同獲取單個核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。3.差速貼壁4.FCM5.免疫磁珠法四.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日四.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)（二)間充質(zhì)干細(xì)胞的二維培養(yǎng)1.低氧張力下的培養(yǎng)2.極低密度傳代培養(yǎng)3.基因轉(zhuǎn)染的MSC培養(yǎng)第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日四.間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)(三）間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)由于二維培養(yǎng)存在著如下缺點(diǎn)：1.貼壁的表面積有限，細(xì)胞產(chǎn)量低；2.無菌操作過程繁瑣，容易污染；3.代謝產(chǎn)物排除不及時，細(xì)胞生長不良；4.細(xì)胞離開體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)，生物學(xué)行為受影響有學(xué)者采用膠原海綿進(jìn)行三維灌注培養(yǎng)，較好。但尚有諸多問題待解決。第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化1.向骨組織的誘導(dǎo)分化

地塞米松

－甘油磷酸抗壞血酸

1,25-（OH）2-D3TGF-IL-6BMP-2

透明質(zhì)酸誘導(dǎo)因素鑒定標(biāo)志堿性磷酸酶；骨橋蛋白；骨鈣蛋白；第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日堿性磷酸酶染色顯示成骨作用第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日VonKossa染色顯示含鈣組織細(xì)胞第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化2.向軟骨組織的誘導(dǎo)分化分離得到的MSC先經(jīng)低速離心形成細(xì)胞微團(tuán)，之后加入無血清培養(yǎng)體系。誘導(dǎo)因素TGF-3Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1,CDMP-1integrin鑒定標(biāo)志CollagenIICollagenIXCartilageoligomericmatrixprotein,COMP第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化3.向脂肪組織的誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)因素地塞米松胰島素吲哚美辛(消炎痛)鑒定標(biāo)志脂肪染色過氧化物酶體增殖激活受體-2脂蛋白脂肪酶脂肪酶結(jié)合蛋白aP2第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日油紅O染色鑒定成脂作用第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日油紅O染色鑒定成脂作用第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化4.向肌肉組織的誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)因素鑒定標(biāo)志兩性霉素B5-氮雜胞苷5-氮-2’脫氧胞苷多核細(xì)胞（形態(tài)）肌球蛋白肌細(xì)胞生成素等第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（一）間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化5.向其他中胚層組織的分化

6.檢測細(xì)胞分化的其他方法上述組織化學(xué)…..分子生物學(xué)….

第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（二）間充質(zhì)干細(xì)胞與相關(guān)因子1.TGF-家族對MSC的作用

TGF-促進(jìn)MSC分化（成骨）

TGF-與其他因子的協(xié)同作用，如與IGF-I的協(xié)同作用（成軟骨）2.BMP對MSC的作用

BMP-2可誘導(dǎo)MSC向成骨和成脂肪方向分化第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日五.間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（二）間充質(zhì)干細(xì)胞與相關(guān)因子3.FGF對MSC的作用

MSC表面有FGF1和FGF2的受體（促增殖)*bFGF單獨(dú)作用具有有絲分裂原作用*bFGF與BMP-2協(xié)同作用可促進(jìn)MSC的成骨能力第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日六.間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究（一）MSC在軟骨組織修復(fù)中的應(yīng)用（1）軟骨表型的誘導(dǎo)分化前述（2）工程化軟骨組織的體外構(gòu)建

（3）細(xì)胞-支架復(fù)合物植入組織缺損處第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日

分離得到的MSC先經(jīng)低速離心形成細(xì)胞微團(tuán)，之后加入無血清培養(yǎng)體系。誘導(dǎo)因素TGF-3Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1,CDMP-1integrin鑒定標(biāo)志CollagenIICollegenIXCartilageoligomericmatrixprotein,COMP軟骨表型的誘導(dǎo)分化第三十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日軟骨組織工程基本方法示意圖A獲取骨髓組織B分離、培養(yǎng)MSCC制備三維支架D將種子細(xì)胞種植于支架E將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入組織缺損處第三十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)中的組織工程耳第三十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日六.間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究（二）MSC在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用1.骨組織工程種子細(xì)胞的來源骨髓來源的MSC最有優(yōu)勢。2.MSC