原核表達(dá)綜述

[Merck推薦]原核表達(dá)秘笈之宿主菌株選擇指南在原核蛋白表達(dá)過(guò)程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件，以獲得最滿意的表達(dá)效果。事實(shí)上，在平時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，最容易被忽視的就是宿主菌的選擇一一多數(shù)人會(huì)直接選擇自己實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用過(guò)的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因一一即使表達(dá)結(jié)果不佳，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會(huì)考究菌株的選擇是否適合。作為原核表達(dá)的宿主，對(duì)外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的。每一個(gè)宿主細(xì)胞都像一個(gè)微觀的小工廠，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務(wù)”一一因?yàn)楹茈y親眼觀察微觀世界中表達(dá)是如何進(jìn)行的，當(dāng)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，我們需要經(jīng)驗(yàn)判斷問(wèn)題所在。宿主細(xì)胞對(duì)原核表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生哪些影響呢？知其然還要知其所以然。比如，菌株內(nèi)源的蛋白酶過(guò)多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株?？胺Q經(jīng)典的BL21系列就是10n和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。真核細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta2系列就是更好的選擇一一這種攜帶PRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。(已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒)當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時(shí)，可以選擇K-12衍生菌Origami2系列，thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase（gor）兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami?2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn)，既補(bǔ)充7種稀有密碼子，又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）OrigamiB是衍生自lacZY突變的BL21菌株，這個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。（四環(huán)素敏感）在決定試用這些名字古怪的菌株時(shí)，有幾個(gè)小Tips要注意的，一個(gè)是不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)?；蛘咭呀?jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta2已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒，不能再用氯霉素篩選等等。現(xiàn)象可能原因改進(jìn)方案建議菌株無(wú)蛋白表達(dá)E.coli的密碼子偏移性補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子Rosetta2Rosetta-gami2Rosetta-gamiBRosettaBlue出現(xiàn)截短蛋白包涵體二硫鍵形成困難降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽Origami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiB表達(dá)過(guò)快，表達(dá)量過(guò)高蛋白錯(cuò)誤折疊控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽TunerRosetta-gamiBOrigami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiB蛋白無(wú)活性控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化TunerRosetta-gamiB細(xì)胞死亡，生長(zhǎng)極困難毒性蛋白更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制pLysS菌株無(wú)克隆生長(zhǎng)過(guò)高本底表達(dá)更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制pLysS、pLysE菌株原核表達(dá)個(gè)人秘笈：表達(dá)前的分析比什么都重要表達(dá)不同于其它一些實(shí)驗(yàn)，比如：提取質(zhì)粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問(wèn)題相對(duì)來(lái)說(shuō)也比較好分析。表達(dá)呢，你把質(zhì)?？寺『美玻唤o細(xì)胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達(dá)在表達(dá)當(dāng)中來(lái)說(shuō)還是比較簡(jiǎn)單，細(xì)菌培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當(dāng)然，它也存在一些缺乏高級(jí)修飾、細(xì)胞內(nèi)部還原性過(guò)高等缺點(diǎn)。原核表達(dá)從一開(kāi)始的設(shè)計(jì)就非常重要，所謂好的開(kāi)始是成功的一半。做足準(zhǔn)備功夫，可是省去很多將來(lái)后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時(shí)嘗試多種表達(dá)系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。前面已經(jīng)介紹過(guò)許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達(dá)體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達(dá)這個(gè)蛋白表達(dá)量奇高，但是另外一個(gè)就是做不出來(lái)，所以沒(méi)有萬(wàn)能的載體，只有永恒的分析。當(dāng)然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)出來(lái)那是最好的，選擇同樣的載體表達(dá)成功率會(huì)高很多。如果沒(méi)有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達(dá)過(guò)和你的蛋白擁有相類似結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)。比如大部分含有哺乳動(dòng)物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達(dá)出來(lái)的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達(dá)。在下面將列出幾個(gè)影響表達(dá)的因素，大家可以在表達(dá)前根據(jù)這幾個(gè)因素自己分析一下：.翻譯起始位點(diǎn)現(xiàn)在大部分的表達(dá)載體都提供起始位點(diǎn)，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的距離進(jìn)行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過(guò)還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子.GC含量表達(dá)序列中的GC含量超過(guò)70%的時(shí)候可能會(huì)降低蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。GC含量可以利用DNASTAR、VectorNTISuite等軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。.二級(jí)結(jié)構(gòu)在起始密碼子附近的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合長(zhǎng)度超過(guò)8個(gè)堿基，這種結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)槲稽c(diǎn)專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。.基因或者蛋白的大小一般說(shuō)來(lái)小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達(dá)的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達(dá)，在每個(gè)表達(dá)單位（即單體蛋白）間設(shè)計(jì)蛋白水解或者是化學(xué)斷裂位點(diǎn)。如果蛋白較小，那么加入融合標(biāo)簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進(jìn)融合的蛋白標(biāo)簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達(dá)。對(duì)于另一個(gè)極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標(biāo)簽，如6義組氨酸標(biāo)簽。對(duì)于結(jié)構(gòu)研究較清楚的蛋白可以采取截取表達(dá)。當(dāng)然表達(dá)時(shí)要根據(jù)目的進(jìn)行截取，如果是要進(jìn)行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強(qiáng)。對(duì)于抗原性也可以利用軟件分析，比如VectorNITSuite或者一些在線軟件，不過(guò)在分析之余也要認(rèn)識(shí)到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)論，如果蛋白和免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的話還是不妨一試的。.親疏水性這也是一種經(jīng)驗(yàn)之談，相信經(jīng)常做表達(dá)的人都發(fā)現(xiàn)表達(dá)親水區(qū)域時(shí)表達(dá)量會(huì)比較高，如果你要表達(dá)一個(gè)膜蛋白，那么勸你做好長(zhǎng)期抗戰(zhàn)的準(zhǔn)備吧。有許多軟件可以對(duì)氨基酸的親疏水性進(jìn)行分析，比如VectorNITSuite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/對(duì)跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)于自己表達(dá)的蛋白有所了解后就可以開(kāi)始對(duì)載體進(jìn)行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個(gè)元件：R-regkjlaLotPpromoterR-regkjlaLotPpromoter起始對(duì)碼J-SD-Shine-Da^ctrnoseci.uenc€IGmsertgeneTTdranE-criptionaItermin5tarf?BS-ribosornebindingshe除了上面標(biāo)出的元件外還需要有復(fù)制起點(diǎn)，它對(duì)于控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)非常重要；另外就是篩選標(biāo)記了，比如藍(lán)白斑篩選的lacZ，各種抗生素標(biāo)記。在以上幾個(gè)元件中，我們需要注意的是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)與啟動(dòng)的元件，也就是調(diào)控子和啟動(dòng)子。其中啟動(dòng)子對(duì)于蛋白表達(dá)的速度起著舉足輕重的作用，它與最終蛋白的表達(dá)量、是否可融密不可分。這里，對(duì)于世面上廣泛銷售的幾種原核表達(dá)載體使用的啟動(dòng)子進(jìn)行總結(jié)。啟動(dòng)子來(lái)源調(diào)控手段（濃度）強(qiáng)度LacUV5乳糖操縱元lacI/IPTG(0.1-1mM)強(qiáng)Trp色氨酸操縱元trpR3-B-吲哚丙烯酸強(qiáng)Tac結(jié)合了色氨酸啟動(dòng)子的-35lacI/IPTG(0.1-1mM)強(qiáng)序列和乳糖啟動(dòng)子的-10序列-PL入噬菌體入cI阻遏物/溫度強(qiáng)噬菌體T5T5噬菌體lacI/IPTG(0.1-1mM)強(qiáng)pBAD阿拉伯糖操縱元AraBAD/阿拉伯糖（1口m-10mM）嚴(yán)謹(jǐn)T7T7RNA聚合酶lacI/IPTG(0.1-1mM)非常強(qiáng)乳糖操縱子是應(yīng)用最廣泛的調(diào)控模式，除了IPTG這種化學(xué)誘導(dǎo)方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學(xué)誘導(dǎo)。如果你害怕這些化學(xué)物質(zhì)會(huì)損害細(xì)菌的生長(zhǎng)，那么你可以嘗試?yán)脺囟日T導(dǎo)的載體，如：pDH2。它利用PL啟動(dòng)子，在溫度上升到42℃后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)?？梢钥吹皆谒袉?dòng)子里屬T7啟動(dòng)子最強(qiáng)，它可以將大腸桿菌的資源最大程度地調(diào)用過(guò)來(lái)表達(dá)外源蛋白。這樣一些難表達(dá)的蛋白都可以在pET系統(tǒng)里面表達(dá)出來(lái)，但是是不是越強(qiáng)就越好呢？如果你需要表達(dá)蛋白是可溶的，那么T7啟動(dòng)子就不那么適合了。較弱的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄速度較慢，這樣對(duì)于表達(dá)可溶、穩(wěn)定、完整的蛋白比較有利。Novagen可以說(shuō)是的pET系統(tǒng)是最王牌的T7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)，可是當(dāng)T7啟動(dòng)子的強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)不受歡迎的時(shí)候怎么辦呢？在這里給讀者留個(gè)小小的疑問(wèn)，看看大家有沒(méi)有仔細(xì)看筆者寫的Novagen篇。提示一下，雖然它轉(zhuǎn)錄速度快，但是可以控制它的拷貝數(shù)，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。載體上除了啟動(dòng)子這個(gè)需要注意之外，另外一個(gè)就是標(biāo)簽了。很多標(biāo)簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達(dá)產(chǎn)物，所以在表達(dá)時(shí)可以選擇加標(biāo)簽。是否加標(biāo)簽要看個(gè)人需要，筆者認(rèn)為如果是表達(dá)一個(gè)人家沒(méi)表達(dá)過(guò)的蛋白最好還是加標(biāo)簽，這樣方便將來(lái)鑒定。如果從經(jīng)濟(jì)角度考慮最好加入6義組氨酸標(biāo)簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標(biāo)簽都無(wú)所謂（前提是不需要融合表達(dá)），結(jié)果加了個(gè)Novagen的T7-Tag,等到鑒定的時(shí)候發(fā)現(xiàn)單抗那么貴。而且還不好買的，一些較少人用的標(biāo)簽會(huì)讓你很傷腦筋。這也是表達(dá)前要準(zhǔn)備的功課之一哦。好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設(shè)計(jì)引物的。相信大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調(diào)出來(lái)的吧。設(shè)計(jì)引物可以使用一下兩個(gè)軟件，PrimerPremier或者Oligo。如果要表達(dá)全長(zhǎng)，其實(shí)也就沒(méi)那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個(gè)匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。不過(guò)，我還是有以下幾點(diǎn)提醒一下各位：.這一點(diǎn)其實(shí)很容易理解，但是有時(shí)也容易被遺忘。那就是先查查表達(dá)外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點(diǎn)，不要設(shè)計(jì)重了，否則酶切時(shí)發(fā)現(xiàn)怎么老是有預(yù)期外的小片段出現(xiàn)。.根據(jù)載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，現(xiàn)在許多類似T載原理的克隆方法也可以應(yīng)用到原核表達(dá)中了，如果T載克隆方法要定向很多時(shí)候要多加4個(gè)堿基，設(shè)計(jì)引物時(shí)候可別忘了加。在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的5’端不要忘了加保護(hù)堿基，不同內(nèi)切酶所需的保護(hù)堿基不同，Sall不需要保護(hù)堿基，EcoRV需要1個(gè)，Notl需要2個(gè)，Hindlll最好有3個(gè)。一般情況下，都設(shè)計(jì)2個(gè)。.注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務(wù)必確定中間這段序列不會(huì)造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個(gè)堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對(duì)載體的不放心，也可以在引物中設(shè)計(jì)上終止密碼子，這樣萬(wàn)無(wú)一失。.還有就是設(shè)計(jì)一對(duì)引物需要注意的地方：一對(duì)引物之間Tm值相差不宜過(guò)大，能一樣最好；一對(duì)引物不宜形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)、互相配對(duì)，若配對(duì)時(shí)最好不要是G-C的結(jié)合（可以用軟件分析）；3'端以G、C結(jié)尾為宜等等。如果要詳細(xì)研究可以看一下PCR技術(shù)的相關(guān)書(shū)籍，很厚。還有就是記得把上游引物設(shè)計(jì)成有義鏈，下游設(shè)計(jì)成反義鏈，否則就沒(méi)有片段出現(xiàn)了。雖然這是很小的地方，可是經(jīng)常會(huì)被忽略。.如果你是進(jìn)行截取表達(dá)，那么除了之前提到的要注意截取親水區(qū)，還有一點(diǎn)就是對(duì)密碼子的使用頻率進(jìn)行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續(xù)出現(xiàn)，還是避開(kāi)它為上策。因?yàn)榧兓瘣?ài)上你:原核表達(dá)GE（原安瑪西亞）篇講起通用電氣醫(yī)療集團(tuán)（GEHealthcare）也許生物方面的研究人員會(huì)比較陌生，這個(gè)從愛(ài)迪生的燈泡講起，擁有百年歷史的大集團(tuán)包括許許多多的行業(yè)（當(dāng)然也不要盲目崇拜把通用汽車也歸到旗下，GM會(huì)生氣的），可是講起蛋白純化等領(lǐng)域首屈一指的安瑪西亞，特別是ECL系列和當(dāng)年的法瑪西亞的Sepharose、Sephadex等大名鼎鼎的純化填料，那么許多做蛋白的人都很熟悉。美國(guó)通用電氣公司2003年10月以總計(jì)高達(dá)95億美金獲得安瑪西亞公司100%的控股權(quán)，這就是轟動(dòng)一時(shí)的儀器行業(yè)內(nèi)最大的收購(gòu)案之一。選擇GE的表達(dá)載體原因很簡(jiǎn)單，愛(ài)屋及烏，使用他們的載體可以方便下一步的純化。雖然在這幾篇的介紹中沒(méi)有強(qiáng)調(diào)純化這個(gè)步驟，但是這不是因?yàn)榧兓恢匾?，而是因?yàn)樗匾?。涉及的?nèi)容太多，根本可以作為一門學(xué)科來(lái)了解，所以就不把“戰(zhàn)線”拖那么長(zhǎng)了。但是在選擇表達(dá)系統(tǒng)的時(shí)候，表達(dá)后的純化方法是必需考慮的非常重要的問(wèn)題。之前我們提到的經(jīng)常用于標(biāo)記的蛋白包括有硫氧還蛋白、6義組氨酸、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）等，6義組氨酸可以說(shuō)是被應(yīng)用的最為廣泛的了，次之就是GE醫(yī)療有專門設(shè)計(jì)的一系列載體的GST了。GST本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)，一個(gè)是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到一種促進(jìn)表達(dá)量提高的作用。6xHistag因?yàn)榉肿恿亢苄∏彝ǔＵJ(rèn)為不會(huì)顯著影目標(biāo)蛋白的活性，在不太嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)中經(jīng)常不需要切割就可以繼續(xù)分析目標(biāo)蛋白（嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)還是必需切割下來(lái)的）。但是GST相比6xHistag分子量要大得多，必需要用蛋白酶將融合蛋白中的GST切下來(lái)。對(duì)于表達(dá)分子量小的目標(biāo)蛋白來(lái)說(shuō)選擇GST就比6xHistag更有優(yōu)勢(shì)一一融合蛋白分子量較大的比較不容易被降解，另外有時(shí)天然蛋白里可能存在5個(gè)連續(xù)的組氨酸（或者非?？拷?個(gè)His）因而也會(huì)被6xHis純化填料吸附而“混入”純化隊(duì)伍中，而GST純化填料的專一性則非常高。順帶提一句，GST融合表達(dá)得到的包含體經(jīng)過(guò)純化后在復(fù)性的過(guò)程中添加適量的谷胱甘肽明顯有助于提高融合蛋白的復(fù)性比率（在還原劑不影響二硫鍵的條件下）。選擇GST載體的同志不可不知。GST系列可是說(shuō)是GE醫(yī)療在原核表達(dá)這塊的王牌產(chǎn)品，總共有13個(gè)載體。這13個(gè)載體中有9個(gè)的多克隆位點(diǎn)是擴(kuò)展過(guò)的，有6個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。擴(kuò)展后的多克隆位點(diǎn)方便我們從入噬菌體載體構(gòu)建的文庫(kù)中將所需的基因克隆出來(lái)并定向插入到表達(dá)載體中。所有載體上都帶有可以將GST切割下來(lái)的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，不同載體攜帶的蛋白酶不同，可以分成T系列、X系列和P系列，分別代表采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE醫(yī)療產(chǎn)的PreScissioM蛋白酶作為蛋白酶切割位點(diǎn)。前面兩個(gè)都是非常經(jīng)典的融合表達(dá)載體的蛋白酶切割位點(diǎn)，但是由于這兩種蛋白酶切割需時(shí)較長(zhǎng)而且要求在室溫條件下切割GST,容易導(dǎo)致目標(biāo)蛋白降解，另外蛋白酶的去除也是比較煩人的問(wèn)題，所以GE公司就推出了新的系列：PreScission。pGEX-6P-3(27-459M1IPreScission*PrdeaMILeuGitVaiLsliP!ieProlL?nGjySerProAsnSerArrjVaiAgpSeiSerG&AmCTGGAAGTTCTGTICCAGG比CCCCTG^GATCCtCC,GAATTOCGG^TCG^TCGAp￡GGCCGtrBarnHIEwR［防日?Sal3曲由?NotIP系列載體是用PreScissionTM酶進(jìn)行切割，它的消化溫度只要5°C，可以最大程度減小對(duì)目的蛋白的降解作用。因?yàn)檫@個(gè)蛋白酶本身通過(guò)基因操作也加上了一個(gè)GST標(biāo)記，所以它可以和被切下來(lái)的GST殘余部分一起通過(guò)谷光甘肽凝膠柱(GlutathioneSepharoseTM)純化去除。這樣就可以極大程度上簡(jiǎn)化了純化的步驟，從這里可以再次看出GE醫(yī)療產(chǎn)品在設(shè)計(jì)上很多時(shí)候總是考慮到下一步的純化步驟的。pGEX-6P有三種載體，以方便你從不同的酶切位點(diǎn)插入都不會(huì)造成移碼突變。另外值得一提的是PGEX-2TK是專門為了體外標(biāo)記融合產(chǎn)物以檢測(cè)表達(dá)情況而設(shè)計(jì)的。它含有來(lái)自心肌的cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位的識(shí)別位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)位于GST和多克隆位點(diǎn)之間。表達(dá)的蛋白可以直接用蛋白激酶和[g-32P]ATP進(jìn)行標(biāo)記，產(chǎn)物可以用放射自顯影技術(shù)穩(wěn)定地檢測(cè)。它的GST可以用凝血酶切除?？偟恼f(shuō)來(lái)，pGEX所有載體都提供了三種不同的翻譯讀碼框選擇；都是利用乳糖操縱子調(diào)控模式，啟動(dòng)子都是Ptac。Ptac是由trp啟動(dòng)子的-35序列和lacUV5的Pribnow序列拼接而成，調(diào)控和lac一樣，但是mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高，表達(dá)也更高，也都利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG本身有毒而似乎不適合表達(dá)醫(yī)藥用途的蛋白。這系列載體都是利用氨芐青霉素進(jìn)行篩選。其中pGEX-1lT，pGEX-6P-1，pGEX-4T-1和pGEX-5X-1都可以接受來(lái)自lgt11文庫(kù)的cDNA片斷并進(jìn)行表達(dá)。在表達(dá)后的檢測(cè)和純化方面，GE醫(yī)療的產(chǎn)品堪稱經(jīng)典。無(wú)論是WesternBlot檢測(cè)表達(dá)，還是五花八門的純化親和層析柱，還有分離凝血酶等絲氨酸蛋白酶的苯甲脒凝膠柱，即使GE醫(yī)療沒(méi)有6義組氨酸標(biāo)記的載體，但是6義組氨酸親和純化相關(guān)產(chǎn)品卻絕對(duì)出色。極速濃縮、1分鐘洗脫，不同規(guī)格的柱子10月期間一直在特價(jià)，詳細(xì)情況可參考生物通首頁(yè)頭條廣告。這里就不詳細(xì)一一介紹了。大家做原核表達(dá)的目的是各式各樣的，有用來(lái)做抗原；也有需要表達(dá)量大,并且需要活性的產(chǎn)物。純化是表達(dá)后絕對(duì)不可小視的一步。所以，回到開(kāi)場(chǎng)白“因?yàn)榧兓瘣?ài)上你”，就是選擇pGEX的最好理由吧！優(yōu)化基因表達(dá)的關(guān)鍵因素之：基因的重新設(shè)計(jì)和合在基因表達(dá)研究中，研究者比較注意選擇合適的表達(dá)載體和宿主系統(tǒng)，而往往忽視基因本身是否與載體和宿主系統(tǒng)為最佳匹配這樣一個(gè)實(shí)質(zhì)性問(wèn)題。基因的最佳化表達(dá)可以通過(guò)對(duì)基因的重新設(shè)計(jì)和合成來(lái)實(shí)現(xiàn)，如消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子，二級(jí)結(jié)構(gòu)最小化，調(diào)整GC含量等。以下就密碼子最佳化、翻譯終止效率和真核細(xì)胞中異源蛋白表達(dá)的問(wèn)題加以說(shuō)明。密碼子最佳化(codonoptimization)遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實(shí)際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，Pichia，植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛(ài)。大腸桿菌、酵母、果蠅、靈長(zhǎng)類等每種生物都有獨(dú)特的8個(gè)密碼子極少被利用［1］。有趣的是，靈長(zhǎng)類和酵母有6個(gè)同樣的利用率低的密碼子。大腸桿菌、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質(zhì)的基因明顯避免低利用率的密碼子。因此，重組蛋白的表達(dá)可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達(dá)系統(tǒng)中)的事實(shí)并不很奇怪。你的基因利用的密碼子可能不是你正在利用的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行高水平表達(dá)所偏愛(ài)的密碼子，這種情況是可能的。利用偏愛(ài)密碼子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密碼子可以合成基因，基因的這種重新設(shè)計(jì)叫密碼子最佳化。在同源表達(dá)系統(tǒng)中，同較低水平表達(dá)的基因相比，較高表達(dá)的基因可能有很不同的密碼子偏愛(ài)。通過(guò)對(duì)密碼子利用的歸類分析，人們可以真正預(yù)測(cè)任何基因在酵母中的表達(dá)水平［2］。在諸如Zeamays的其他生物中，大量高表達(dá)基因強(qiáng)烈偏愛(ài)以G或C結(jié)尾的密碼子［3］。而且，在Dictyostelium中，同低水平表達(dá)的基因比較，高表達(dá)基因有較大數(shù)目的偏愛(ài)密碼子［4］。在大腸桿菌中表達(dá)哺乳動(dòng)物基因是不可預(yù)測(cè)和具有挑戰(zhàn)的。例如直到最近才實(shí)現(xiàn)了人血紅蛋白的過(guò)表達(dá)［5］。為了達(dá)到血紅蛋白的好的表達(dá)水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子進(jìn)行重新合成。在異源宿主中實(shí)現(xiàn)象血紅蛋白這樣復(fù)雜的蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)可能需要最佳化密碼子，這些研究者為此提供了令人信服的資料。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運(yùn)動(dòng)，這是基因不能以合適水平表達(dá)的一個(gè)明顯機(jī)制。核糖體翻譯由九個(gè)密碼子組成的信使（含幾個(gè)低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子）時(shí)的運(yùn)動(dòng)速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長(zhǎng)的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于3’端，信使最后也會(huì)被核糖體“擁擠”而損害，核糖體又回到5’端。3’端低利用率密碼子簇的抑制效應(yīng)可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應(yīng)一樣大。如果低利用率密碼子簇位于5’端，其效應(yīng)是起始核糖體數(shù)目的全面減少，導(dǎo)致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密碼子對(duì)翻譯的效應(yīng)還未很好地研究，但是有證據(jù)表明這種情況的確對(duì)翻譯效率有負(fù)面效應(yīng)［6］。其他因素也可以影響蛋白表達(dá)，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。重新設(shè)計(jì)合成基因可以去除或改變這些序列，導(dǎo)致高水平表達(dá)。消除稀有密碼子、去除任何去穩(wěn)定序列和利用最佳密碼子的基因的重新設(shè)計(jì)都可能增加蛋白產(chǎn)量，使的蛋白生產(chǎn)