【報(bào)告】紙層析法分離氨基酸實(shí)驗(yàn)報(bào)告

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紙層析法分別氨基酸一、前言紙層析法紙層析法又稱紙色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的一種分別技術(shù)。本世紀(jì)初俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett覺(jué)察并使用這一技術(shù)證明白植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素移動(dòng)距離(Rf值)用適宜方法定量(如光度法、比色法等)。紙層析法(paperchromatography)于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測(cè)定;也是定性或定量測(cè)定多肽、核酸堿基、糖、有層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶溶劑是流淌相。3，4-GC、HPLC應(yīng)用普遍。做葉綠體色素分別時(shí)用到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液(石油醚)混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對(duì)含量和種類。ab反之則慢;含量較多者色素帶也較寬。最終在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法能清楚地將葉綠體中的色素分別。氨基酸2l世紀(jì)全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需求量越來(lái)越大，1008002060年月起，氨基酸的應(yīng)用在食品工業(yè)占61,，在飲料工業(yè)占30,，醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人類生活的很多方面都有著應(yīng)用:在食品德業(yè)的應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用在化裝品德業(yè)的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用在其他行業(yè)的應(yīng)用氨基酸工業(yè)還有著寬闊的進(jìn)展前景:傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法運(yùn)用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸大力進(jìn)展藥用中間體,具體為:①氨基酸及其衍生物漸漸成為藥用中間體②非自然氨基酸是合成活性藥物的重要原料③生產(chǎn)高附加值的非自然氨基酸二、試驗(yàn)?zāi)康陌盐瞻才艑游龅脑?，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)(包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量)。學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分(水解、層析及鑒定)分析的方法。三、試驗(yàn)原理紙層析是以濾紙為惰性支持物的安排層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層分別。溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用比移值Rf值表示：Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的構(gòu)造、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本試驗(yàn)利用紙層析法分別氨基酸。四、試驗(yàn)試劑和器材試驗(yàn)試劑：氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。2.80%甲酸氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL)正丁醇試驗(yàn)器材：華濾紙培育皿電熱鼓風(fēng)枯燥箱吹風(fēng)機(jī)毛細(xì)管針、線、尺。鐘罩(430mm,290mm，具磨口塞)五、操作步驟標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析單向上行層析Rf值的測(cè)定濾紙：選用國(guó)產(chǎn)華1號(hào)濾紙，6cm×7cm2cm處劃線，用鉛筆在線上標(biāo)上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子〔留出縫線空間〕。點(diǎn)樣：清；中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出；0.5cm樣品干后再點(diǎn)其次滴，為使樣品加速枯燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要留意溫度不行過(guò)高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果；④將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。留意縫線而造成溶劑前沿不齊，影響Rf1cm劑前沿位置。65℃10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點(diǎn)。RfRf3Rf80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml25℃，1h。六、試驗(yàn)結(jié)果亮氨酸甘氨酸脯氨酸待測(cè)氨基酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中6.052.903.492.61心的距離3.746.47原點(diǎn)到溶劑前沿的距離7.247.247.247.24Rf0.840.400.480.360.520.89推斷待測(cè)氨基酸推斷待測(cè)氨基酸亮氨酸甘氨酸脯氨酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸理論Rf0.790.300.48七、留意事項(xiàng)點(diǎn)樣過(guò)程中必需在第一滴樣品干后再點(diǎn)其次滴；以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果；將揉成圓筒狀的濾紙放入培育皿內(nèi)時(shí)，留意濾紙不要碰皿壁；使用的溶劑系統(tǒng)需穎配制，并要搖勻；清；析紙，由于手上常常有少量含氮物質(zhì)。顯色時(shí)它也呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。污中的氨；展層開(kāi)放時(shí)切勿是樣品點(diǎn)浸入溶劑中。八、思考題統(tǒng)？Nernst1891的濃度比為一，即(Kd)。Kd=Ca/CbCaCbA相和B質(zhì)在A和B何影響?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的堿式電離，氨基結(jié)合質(zhì)子，整個(gè)分子帶正電荷；反之，堿性溶液中有利于羧基的酸式電離，氨基酸分子整體帶負(fù)電荷。酸性溶劑系統(tǒng)(或堿性溶劑系統(tǒng))對(duì)堿性氨基酸(賴、精、組)RfRf值增大。反之，堿性性溶Rf值增大。什么是安排系數(shù)？答：安排系數(shù)是指肯定溫度下，處于平衡狀態(tài)時(shí)，組分在固定相中的濃度和在流淌相中的濃度之比，以K九、爭(zhēng)論利用紙層析法分別氨基酸的具體流程及方法，并且了解了其工作原理，這對(duì)于以后的學(xué)習(xí)是有很大幫助的。經(jīng)查閱資料得，亮氨酸的理論Rf0.79〔酸相〕，脯氨酸的理論Rf0.48〔酸相〕，甘氨酸的理論Rf0.30〔酸相〕。通過(guò)比對(duì)濾紙上單一氨基酸層析位置、計(jì)算出其試驗(yàn)Rf了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸這三種氨基酸?？傮w來(lái)講，本次試驗(yàn)三種氨基酸試驗(yàn)Rf得出幾點(diǎn)影響試驗(yàn)結(jié)果的因素，如下：點(diǎn)樣過(guò)程中未在第一滴樣品干后再點(diǎn)其次滴；雖用玻璃罩將濾紙罩住，但還是會(huì)有些許空氣中的氨在其中，影響試驗(yàn)結(jié)果；將揉成圓筒狀的濾紙放入培育皿內(nèi)時(shí)，濾紙不留神觸遇到皿壁，消滅虹吸現(xiàn)象；使用穎配制的溶劑系統(tǒng)時(shí)，并未完全搖勻；析紙，由于手上常常有少量含氮物質(zhì)。顯色時(shí)它也呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。污并未戴橡皮手套或指套，在制作濾紙筒時(shí)手不留神觸