流式細(xì)胞儀教程

流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。什么是流式細(xì)胞術(shù)(FCM)？特點(diǎn):

單細(xì)胞的流動(dòng)的活細(xì)胞的定量的多參數(shù)的高統(tǒng)計(jì)學(xué)精度的分選細(xì)胞第一節(jié)流式細(xì)胞儀的分析及分選原理第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析第三節(jié)流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求第四節(jié)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中應(yīng)用

一工作原理：

FCM是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下的高度自動(dòng)化的細(xì)胞顯微熒光脈沖分光光度儀。第一節(jié)流式細(xì)胞儀的分析及分選原理

1、液流系統(tǒng)樣品流和鞘流2、光學(xué)系統(tǒng)激光、透鏡組、光電倍增管等。3、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(一）基本組成構(gòu)InjectorTip熒光信號(hào)激光束Sheathfluid樣品流和鞘流1、液流系統(tǒng)PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

激光、透鏡組、光電倍增等。2、光學(xué)系統(tǒng)

（二）基本工作原理單細(xì)胞流：流動(dòng)室單細(xì)胞照明：激光488nmlaser488nmlaser單細(xì)胞檢測(cè)：信號(hào)處理（一）前向散射光(fowordscatter)：FSC

信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)（二）側(cè)向散射光（sidescatter)：SSC

信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)二散射光的測(cè)定FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無(wú)關(guān).90DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無(wú)關(guān).前向散色光FSC側(cè)向散色光SSC

利用前向角和測(cè)向角散射光可以把外周血白細(xì)胞分成三群，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。散射光的測(cè)定

熒光檢測(cè)器檢測(cè)特定熒光的特定發(fā)射波長(zhǎng)（一）光信號(hào)測(cè)量

線性放大器對(duì)數(shù)放大器三熒光測(cè)量EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLinesDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm（二）熒光補(bǔ)償

利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償”（一）分選的基本原理488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector四細(xì)胞分選原理陽(yáng)性選擇MACS-MagneticCellSorting磁珠分離陰性選擇1、分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞/秒2、分選純度:99.5%左右3、分選收獲率:90-95%4、分選得率（二）分選的技術(shù)要求

分選純度是指分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。分選收獲率

是指分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分比。第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示和分析

一、參數(shù)前向散射光FS:

反映顆粒的大小側(cè)向散射光SS:

細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度熒光FL:

細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少二、數(shù)據(jù)的顯示方式（一）單參數(shù)直方圖（二）雙參數(shù)顯示（三）三參數(shù)顯示

以分布直方圖(distributionhistogram)來(lái)顯示，橫軸為該參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的。縱軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。(一)單參數(shù)直方圖的顯示Single-ParameterHistogramDisplaysX軸表示綠熒光信號(hào)(CD3)強(qiáng)弱,Y軸則反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量.(二)雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示Two-ParameterDataDisplays

細(xì)胞雙參數(shù)測(cè)定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二個(gè)參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更多的生物學(xué)信息。雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用的是二維的散點(diǎn)圖(DotPlot)。在二維圖上，橫軸代表第一個(gè)測(cè)量參數(shù)，縱軸代表第二個(gè)測(cè)量參數(shù)。

縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),在圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞1、點(diǎn)圖用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。2、二維等高圖

縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),Z軸為細(xì)胞數(shù)。3、假三維等高圖

三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。(三)三參數(shù)直方圖

一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門(mén)（Gate)技術(shù)，來(lái)分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析1、Region設(shè)置2、設(shè)置Gate

樣品制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液特定熒光染料的選擇：光譜重疊陰性對(duì)照的設(shè)置:檢測(cè)標(biāo)本的重復(fù)性質(zhì)量控制第三節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

細(xì)胞碎片細(xì)胞團(tuán)塊離心漂洗固定劑一、免疫檢測(cè)樣品制備

淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。Ficoll,40kd，高密度，低滲透壓，無(wú)毒性。（比重為1.0177±0.001的分層液).（一）外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備

利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散色光點(diǎn)圖

單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。（二)培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備

機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。

酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。

化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。表面活性劑處理法：Triton-100、皂素等。(三)新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備

機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量。如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾團(tuán)塊等，也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除團(tuán)塊和碎片的干擾。

酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)造成所測(cè)化學(xué)成份的不良影響。FCM所測(cè)細(xì)胞是單個(gè)分散狀態(tài)；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。

防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。(四）單細(xì)胞懸液的保存

染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光信號(hào)的產(chǎn)生（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)（nm)發(fā)射波長(zhǎng)（nm)顏色FITC488525深藍(lán)色PE(RDI)488575橙色ECD488620橙紅色PeCy-5488670紅色PeCy-7488755深紅色PI488620橙紅色APC633670紅色FITC488525深藍(lán)色PE(RDI)488575橙色ECD488620橙紅色PeCy-5488670紅色PeCy-7488755深紅色PI488620橙紅色APC633670紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserCY5PECY5CY5488nm能量傳遞染料：熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式：結(jié)構(gòu)親和方式嵌入結(jié)合方式共價(jià)結(jié)合方式熒光抗體特異性結(jié)合方式1、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色（二）免疫熒光標(biāo)記3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色568615紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+APC488525、575綠色、橙色633670紅色熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)（nm)發(fā)射波長(zhǎng)（nm)顏色

FITC的激發(fā)波長(zhǎng)處于自發(fā)熒光的光譜區(qū)內(nèi)，因此FITC熒光易受自發(fā)熒光的干擾。(三)細(xì)胞的自發(fā)熒光（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)量控制（二）細(xì)胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制

1、溫度對(duì)熒光染色的影響2、pH對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響3、熒光染料濃度的控制4、固定劑對(duì)熒光染色的影響（三）儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制三、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制

1、同型對(duì)照：選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照（陰性對(duì)照）2、全程質(zhì)控：在流式檢測(cè)中，樣品標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)行全程質(zhì)控，使得同類實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可以互用。（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)量控制一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的一群重要細(xì)胞群，是參與免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞免疫功能的免疫活性細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，各自發(fā)揮不同的作用。第四節(jié)流式細(xì)胞在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用三色標(biāo)記淋巴細(xì)胞T、B、

NK1、Th細(xì)胞：CD3+CD4+CD8-T細(xì)胞，能輔助B細(xì)胞分化成熟生成抗體產(chǎn)生細(xì)胞（槳細(xì)胞），參與促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。（一）淋巴細(xì)胞及其亞群分析2、Tc細(xì)胞：

CD3+CD4-CD8+T細(xì)胞，能特異性直接殺傷靶細(xì)胞，所有表達(dá)MHCI類分子的靶細(xì)胞?？鼓[瘤免疫，抗病毒感染，移植排斥反應(yīng)和自身免疫疾病中均起了重要作用。B細(xì)胞約為5%-10%，標(biāo)志為BCR，膜表面免疫球蛋白（Smlg）。表達(dá)CD19、CD20、CD21、CD22分子。B細(xì)胞也是免疫系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，主要功能是介導(dǎo)體液免疫?？乖f呈細(xì)胞，能攝取、加工和遞呈抗，同時(shí)還能分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。(二）B淋巴細(xì)胞及其亞群

自然殺傷細(xì)胞（Naturalkillercell,NK細(xì)胞）為一組大顆粒的淋巴細(xì)胞，5%-10%左右，標(biāo)志CD16、CD56、CD2、CD11a/CD18。用三色熒光標(biāo)記將CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞定為NK細(xì)胞。主要功能是參