十六章-抗生素藥物的分析

第十六章抗生素類藥物分析第一節(jié)概述一、抗生素的定義及特點(diǎn)◆低化學(xué)純度－同系物多、異構(gòu)體多、降解物多◆活性組分的變異性－生產(chǎn)過(guò)程中條件的變化◆不穩(wěn)定性－不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)

是指“生物在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱”抗生素的分類β－內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多烯大環(huán)類抗生素－制菌霉素、兩性霉素多肽類抗生素－放線菌素、多黏菌素酰胺醇類抗生素－氯霉素抗腫瘤類抗生素其他抗生素二、抗生素類藥物的分類按化學(xué)結(jié)構(gòu)分三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性◆1、耐藥性的種類固有耐藥性：天然耐藥性，由細(xì)菌染色體基因決定獲得性耐藥性：◆2、耐藥的機(jī)制（1）產(chǎn)生滅活酶，使抗菌藥失活如β-內(nèi)酰胺酶（2）抗菌藥物作用靶位改變（3）降低細(xì)菌外膜通透性（4）影響主動(dòng)流出系統(tǒng)四、抗生素藥物的質(zhì)量分析鑒別試驗(yàn)㈠1、官能團(tuán)的顯色反應(yīng)－特殊基團(tuán)的反應(yīng)2、光譜法－特征吸收3、色譜法－保留行為4、生物學(xué)方法－抗菌能力㈡檢查1、影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目－水份、酸堿度等2、控制有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)的檢查項(xiàng)目3、與臨床安全性密切相關(guān)的檢查項(xiàng)目－異常毒性、熱原等4、其他檢查項(xiàng)目－其他共存組分㈢含量或效價(jià)測(cè)定1、微生物檢定法比濁法管碟法－抑菌圈效價(jià):是指每ml或每mg中含有某種抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素對(duì)微生物的殺傷或抑制程度為指標(biāo)來(lái)判斷效價(jià)的一種方法方法靈敏度高、需用量少適用范圍廣－純品、不純品、已知的和新的可一次測(cè)定同類型抗生素的總效價(jià)－無(wú)需分離純化與臨床的應(yīng)用要求一致操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力誤差較大是結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多組分抗生素效價(jià)測(cè)定的首先方法優(yōu)點(diǎn)㈢含量或效價(jià)測(cè)定1、微生物檢定法缺點(diǎn)

2、物理化學(xué)法

HPLCLC-MSUV

容量法準(zhǔn)確可靠、專屬性高、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、樣品用量少1、對(duì)結(jié)構(gòu)已知或提純的抗生素2、需要標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照儀器分析方法㈢含量或效價(jià)測(cè)定第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素β-內(nèi)酰胺類抗生素6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素類；7-氨基頭孢菌烷酸（7-ACA）；頭孢菌素類；一、結(jié)構(gòu)及分類氫化噻嗪環(huán)氫化噻唑環(huán)阿莫西林

（羥氨芐青霉素）頭孢羥氨芐㈡理化性質(zhì)1、酸性與溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不穩(wěn)定性酸性一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基

易溶于水

與有機(jī)堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素（二）手性C

頭孢菌素類

C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡

（三）共軛體系

頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無(wú)明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性

水溶液

不穩(wěn)定

干燥純凈

穩(wěn)定

不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解

含水量純度

青霉素類

某些氧化劑酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)

與含水量和純度密切相關(guān)青霉素的降解途徑青霉素的降解產(chǎn)物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－強(qiáng)酸性環(huán)境青霉烯酸－弱酸性環(huán)境青霉醛－強(qiáng)酸性-加熱青霉胺－強(qiáng)酸性-加熱/青霉素酶-重金屬降解產(chǎn)物二、鑒別反應(yīng)（一）顯色反應(yīng)1、異羥肟酸鐵反應(yīng)H2NOHHClC2H5OH（紅、棕、褐）2.茚三酮反應(yīng)

α-氨基-氨基茚三酮藍(lán)紫色烯醇式茚三酮酮式茚三酮縮合藍(lán)紫色+H2OCNCH2RC=ORCHH2NCOOHOC=COCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO3.雙縮脲反應(yīng)似肽鍵（開環(huán)分解）-內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫紅色紫紅色4.與重氮苯磺酸反應(yīng)橙黃色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羥基頭孢哌酮1.K+、Na+的火焰反應(yīng)（二）各種鹽的反應(yīng)

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉→↓白

K+色譜法（三）1、TLC法對(duì)照品對(duì)照法2、HPLC法光譜法（四）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉

A280nm/A264nm=1.30～1.502、IR法3180cm-1N-Hβ–內(nèi)酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林為例三、雜質(zhì)檢查

藥物

檢查項(xiàng)目

檢查方法

頭孢他啶聚合物HPLC法

頭孢曲松鈉

頭孢哌酮鈉

頭孢噻肟鈉

頭孢呋辛酯有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體HPLC法

頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)反相TLC法

青霉素鉀（鈉）吸收度紫外分光光度法

1.頭孢他啶聚合物的測(cè)定分子排阻色譜法

固定相：葡聚糖凝膠G-10

流動(dòng)相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液

流動(dòng)相B：0.01%十二烷基硫酸鈉

對(duì)照品溶液：頭孢他啶對(duì)照品100μg/ml

1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000、流動(dòng)相A測(cè)定；重復(fù)性用對(duì)照品溶液、流動(dòng)相B測(cè)定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%

2）測(cè)定方法

進(jìn)樣供試液，用流動(dòng)相A；進(jìn)樣對(duì)照液，用流動(dòng)相B。以外標(biāo)法計(jì)算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得超過(guò)0.3%。2.頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

異構(gòu)體異構(gòu)體A異構(gòu)體B△3-異構(gòu)體E異構(gòu)體控制比例有關(guān)物質(zhì)

3）異構(gòu)體：

相對(duì)保留時(shí)間1--被測(cè)物

2--標(biāo)準(zhǔn)物異構(gòu)體相對(duì)保留時(shí)間判斷B異構(gòu)體0.85供試液譜圖中A異構(gòu)體的峰面積A異構(gòu)體1.0與A、B異構(gòu)體峰面積和之比應(yīng)為0.48~0.55。

異構(gòu)體A異構(gòu)體B頭孢呋辛酸△3-異構(gòu)體E異構(gòu)體E異構(gòu)體有關(guān)物質(zhì)高低濃度自身對(duì)照法（1%）有關(guān)物質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間判斷△3-異構(gòu)體1.2不得大于對(duì)照液主峰面積之和的1.5倍（1.5%）E異構(gòu)體1.7和2.1不得大于對(duì)照液主峰面積之和（1.0%）其他雜質(zhì)不得大于對(duì)照液主峰面積之和的1/2（0.5%）所有雜質(zhì)不得大于對(duì)照液主峰面積之和的3倍（3.0%）3.青霉素鈉（鉀）的吸收度檢查：供試液1.80mg/ml，

結(jié)果判斷：A280不得大于0.10，在264nm處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80-0.88.（一）高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保留行為的不同而實(shí)現(xiàn)高效分離，并與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)照，而對(duì)其進(jìn)行定量的一種方法。優(yōu)化色譜分析條件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation四、含量測(cè)定-容量法和儀器分析法實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1）色譜峰要達(dá)到較好的分離－基線分離(baseseparation)（2）需要標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，用外標(biāo)法定量（3）可同時(shí)測(cè)定多個(gè)組分的含量（4）需要排除制劑中輔料等雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾（二）生物樣本中β-內(nèi)酰胺類抗生素的分析血漿尿樣唾液膽汁生物樣本色譜柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)樣品制備：取血漿200μL，加入內(nèi)標(biāo)5μL，再加入HCLO4，窩旋提取InternalstandardIS第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素鏈霉素：鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺****

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素

3個(gè)慶大霉素5個(gè)堿性中心堿性（一）水溶性溶解性（二）鏈霉素

pH5～7.5慶大霉素

pH2～12

穩(wěn)定穩(wěn)定性（四）UV（三）鏈霉素的鏈霉胍在230nm有UV吸收慶大霉素、奈替米星等無(wú)UV吸收坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)二、

鑒別

茚三酮反應(yīng)（一）△羥基胺類和α-氨基酸性質(zhì)+△藍(lán)紫色（二）Molisch試驗(yàn)具有五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)H+糠醛羥甲基糠醛α-萘酚紅紫色蒽酮藍(lán)紫色糠醛與α-萘酚呈色原理紅紫色羥甲基糠醛糠醛與蒽酮的呈色原理羥甲基糠醛藍(lán)紫色（三）N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)乙酰丙酮OH-吡咯衍生物（I）對(duì)二甲氨基苯甲醛H+櫻桃紅色（II)（Elson-Morgan反應(yīng)）新霉素巴龍霉素(縮合)櫻桃紅色對(duì)二甲氨基苯甲醛H+

（4）麥芽酚反應(yīng)－鏈霉素的特征反應(yīng)

H+分子重排麥芽酚鏈霉素特有反應(yīng)（或α-萘酚）8-羥基喹啉（五）坂口反應(yīng)α-萘酚＋8－羥基喹啉鏈霉胍（六）硫酸鹽反應(yīng)H+鹽酸or硝酸不溶（七）色譜法：1.TLC多以硅膠為薄層板，三氯甲烷-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸汽為顯色劑。2.HPLC供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖進(jìn)行鑒別（八）UV法鏈霉素在230nm處有紫外吸收。慶大霉素、奈替米星等無(wú)紫外吸收。（九）IR法特殊雜質(zhì)的檢查及組分分析（一）鏈霉素中鏈霉素B1.來(lái)源——發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的甘露糖鏈霉素2.活性——鏈霉素的20%-25%3.檢查方法——TLC/水解，甘露糖為對(duì)照3.色譜條件——薄層板：硅膠G

顯色劑：1,3萘二酚-硫酸++410.pH吲哚衍生物巰基醋酸鄰苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.(二）慶大霉素中組分C的檢查－衍生化后HPLC色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、衍生化條件的摸索。

組分C的毒副作用和耐藥性與慶大霉素有差異，導(dǎo)致產(chǎn)品的效價(jià)和臨床療效1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物RP－HPLC方法

2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計(jì)算

3.峰面積歸一化法四、

含量測(cè)定微生物檢定法

比濁法、管碟法HPLC法無(wú)ＵＶ吸收－不能直接用ＵＶ、熒光檢測(cè)器

柱前、后衍生化－ＵＶ檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器第四部分：四環(huán)素類抗生素Trtracyclines

TC

理化特性（1）酸堿兩性－C4（二甲氨基）、C10（酚羥基）（2）旋光性－含有手性中心（一般為左旋）（3）紫外吸收特性－具有共軛雙鍵體系（吸收波長(zhǎng)為長(zhǎng)波方向）（4）與金屬離子的配位化合物反應(yīng)－酚羥基和烯醇基（5）不穩(wěn)定性－對(duì)各種外界條件，包括氧化劑、酸、堿，易形成差向、脫水和異四環(huán)素，顏色加深弱酸性環(huán)境ETC差向四環(huán)素強(qiáng)酸性環(huán)境ATC脫水四環(huán)素堿性環(huán)境EATC異四環(huán)素差向脫水四環(huán)素二、

鑒別試驗(yàn)

濃H2SO4反應(yīng)（一）黃色朱紅色→黃色蘭色→黃色紫紅色→黃色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素42SOH鹽酸美他環(huán)素橙紅色FeCl3反應(yīng)（二）褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素3FeClTLC法（三）鹽酸土霉素的鑒別

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象比較保留時(shí)間三、

特殊雜質(zhì)檢查

·

4-差向四環(huán)素（ETC）

·脫水四環(huán)素（ATC）

·差向脫水四環(huán)素（EATC）

·鹽酸金霉素（CTC）

有關(guān)物質(zhì)（一）HPLC法（2000版）鹽酸四環(huán)素四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％吸收度（二）nmmax355268l、鹽酸四環(huán)素雜質(zhì)吸收度

取供試品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm處測(cè)定，其吸收度不得超過(guò)0.12。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間四、

含量測(cè)定HPLC法

鹽酸四環(huán)素的測(cè)定

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：鹽酸四環(huán)素、有關(guān)