實(shí)驗(yàn)1顯微鏡的使用細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)一顯

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用細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色(3學(xué)時(shí))實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及教材：實(shí)驗(yàn)2、7、12等。一目的要求

1復(fù)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和操作技術(shù)；學(xué)習(xí)油鏡的工作原理和使用方法；

2掌握細(xì)菌的制片和簡(jiǎn)單染色技術(shù)，觀察球菌和桿菌等在光學(xué)顯微鏡下的基本形態(tài)特征；

3建立“無(wú)菌概念”，體會(huì)無(wú)菌操作的重要性。二實(shí)驗(yàn)器材

1菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

2溶液和試劑香柏油、二甲苯、呂氏堿性美蘭染液、水等。

3儀器和其它用品普通光學(xué)顯微鏡、載玻片、酒精燈、火柴、擦鏡紙、接種環(huán)、廢液缸、濾紙、紗布等。三基本原理㈠普通光學(xué)顯微鏡微生物個(gè)體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到，顯微鏡是微生物學(xué)者不可缺少的基本工具。普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡、物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，常稱(chēng)為復(fù)式顯微鏡，由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。1機(jī)械裝置鏡座和鏡臂：鏡座支持整個(gè)顯微鏡，鏡臂支持鏡筒部分。鏡筒：上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，分為單筒和雙筒兩種。轉(zhuǎn)換器：是一個(gè)金屬圓盤(pán)，上面裝有3-4個(gè)物鏡，可以使物鏡通過(guò)鏡筒和目鏡組成一個(gè)放大系統(tǒng)。載物臺(tái)：放置鏡檢標(biāo)本，中間有通光孔。載物臺(tái)上裝有標(biāo)本夾和標(biāo)本推進(jìn)器，在推動(dòng)器上具有刻度，能夠確定標(biāo)本位置，便于找到觀察視野。調(diào)焦裝置：

調(diào)節(jié)物鏡與標(biāo)本間距離的結(jié)構(gòu)。粗動(dòng)螺旋微動(dòng)螺旋2光學(xué)系統(tǒng)物鏡：安裝在轉(zhuǎn)換器上，將物體第一次放大，決定顯微鏡的成像質(zhì)量和分辨能力。目鏡：安裝在鏡筒上端，由兩塊透鏡組成，將物鏡成的像再次放大，但是不增加分辨力，目鏡放大倍數(shù)過(guò)大，反而影響觀察效果。聚光器：由聚光鏡和虹彩光圈組成，調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，使適當(dāng)強(qiáng)度的光線照射到標(biāo)本上。光源：安裝在鏡座內(nèi)，通過(guò)開(kāi)關(guān)控制。濾光片：可見(jiàn)光由不同波長(zhǎng)的光線組成，使用濾光片可以得到所需的一種波長(zhǎng)的光線，提高分辨率、增加反差。一臺(tái)顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)組成，其中物鏡是顯微鏡最重要的部件。物鏡通常有三種，低倍鏡、高倍鏡、油鏡。低倍鏡的放大倍數(shù)一般為4-10×、高倍鏡的放大倍數(shù)一般為40-45×、油鏡為95-100×，是放大倍數(shù)最大的物鏡。㈡油鏡的工作原理1提高分辨率

0.5l最小可分辨距離=————

nsinq分辨率是決定顯微鏡觀察效果的重要指標(biāo)，顯微鏡分辨率越高，能達(dá)到的最小可分辨距離越小。λ為所用光源波長(zhǎng)；n=載玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。鏡口角是光線投射到物鏡上的最大角度，q為物鏡鏡口角半數(shù)，取決于物鏡的直徑和工作距離。

n：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。顯微鏡數(shù)值孔徑(numericalaperture,NA)：指鏡口角一半的正弦與載玻片物鏡間介質(zhì)折射率的乘積，是決定物鏡性能的最重要指標(biāo)?？諝?n=1.0)、水(n=1.33)、香柏油(n=1.52)，介質(zhì)折射率提高數(shù)值孔徑值提高分辨率提高。

0.5l最小可分辨距離=————

nsinq光線在穿過(guò)折射率不同的介質(zhì)時(shí)發(fā)生折射。2提高照明度空氣(n=1.00)玻璃(n=1.52)很多原來(lái)由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。對(duì)于油鏡：工作介質(zhì)是香柏油?？諝?n=1.00)

玻璃(n=1.52)

香柏油(n=1.52)對(duì)于低倍鏡和高倍鏡：介質(zhì)是空氣㈢細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色細(xì)菌個(gè)體微小，無(wú)色透明，不經(jīng)過(guò)染色，常常不容易觀察。經(jīng)過(guò)染色后，菌體與背景顏色形成鮮明的顏色對(duì)比，便于在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小和排列方式。利用單一染料對(duì)菌體進(jìn)行染色的方法稱(chēng)為簡(jiǎn)單染色。用于生物染色的堿性染料不是堿而是一種鹽，堿性染料電離時(shí)染料離子帶正電荷，而細(xì)菌蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液時(shí)常帶負(fù)電荷，這樣帶負(fù)電荷的細(xì)菌很容易與帶正電荷的染料離子結(jié)合而使細(xì)菌著色。常用的堿性染料有美蘭、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、番紅等。室溫或烘干1小滴生理鹽水四操作步驟㈠細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色涂片干燥固定染色水洗鏡檢2-3次美蘭，2-3min濾紙吸干㈡顯微鏡使用及細(xì)菌基本形態(tài)觀察1觀察前準(zhǔn)備顯微鏡安置：置顯微鏡于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約為10cm左右，鏡檢者姿勢(shì)要端正。光源調(diào)節(jié)：適當(dāng)調(diào)節(jié)聚光器的高度可以改變視野亮度，但是一般情況下聚光器在使用中都是調(diào)到最高位置。調(diào)節(jié)目鏡間距和屈光度。聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)方法見(jiàn)教材，但是做普通觀察時(shí)可以不用調(diào)節(jié)。瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)：可以適應(yīng)雙眼視力有差異的觀察者。2低倍鏡觀察養(yǎng)成良好的調(diào)焦習(xí)慣，先從側(cè)面注視，小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用目鏡觀察，以防操作失誤而損壞鏡頭。3高倍鏡觀察一般情況下，當(dāng)物像在一種物鏡中清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器將其它物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，物像保持基本準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)，稱(chēng)為物鏡的同焦(parfocal)。利用同焦現(xiàn)象，在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時(shí)，僅用微動(dòng)螺旋即可對(duì)物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗動(dòng)螺旋時(shí)可能的錯(cuò)誤操作而損壞鏡頭。4油鏡觀察注意不要因?yàn)樵谙陆滴镧R鏡頭時(shí)用力過(guò)猛或者調(diào)焦時(shí)誤將粗動(dòng)螺旋向反方向轉(zhuǎn)動(dòng)而損壞鏡頭及載玻片。不可以將高倍鏡轉(zhuǎn)動(dòng)經(jīng)過(guò)加油鏡油的區(qū)域。5顯微鏡用畢后處理下降載物臺(tái)，取下載玻片；分三步用擦鏡紙清理鏡頭。將顯微鏡還原。包括將光源燈亮度調(diào)至最低后關(guān)閉；將最低放大倍數(shù)物鏡轉(zhuǎn)到工作位置；載物臺(tái)及聚光器降至最低位置。五注意事項(xiàng)

1嚴(yán)格、標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)行無(wú)菌操作。