實驗1顯微鏡的使用細菌的簡單染色

微生物學實驗生命科學學院實驗一顯

微

鏡

的

使

用細菌的簡單染色(3學時)實驗內(nèi)容涉及教材：實驗2、7、12等。一目的要求

1復習普通光學顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和操作技術；學習油鏡的工作原理和使用方法；

2掌握細菌的制片和簡單染色技術，觀察球菌和桿菌等在光學顯微鏡下的基本形態(tài)特征；

3建立“無菌概念”，體會無菌操作的重要性。二實驗器材

1菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

2溶液和試劑香柏油、二甲苯、呂氏堿性美蘭染液、水等。

3儀器和其它用品普通光學顯微鏡、載玻片、酒精燈、火柴、擦鏡紙、接種環(huán)、廢液缸、濾紙、紗布等。三基本原理㈠普通光學顯微鏡微生物個體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到，顯微鏡是微生物學者不可缺少的基本工具。普通光學顯微鏡利用目鏡、物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，常稱為復式顯微鏡，由機械裝置和光學系統(tǒng)兩大部分組成。1機械裝置鏡座和鏡臂：鏡座支持整個顯微鏡，鏡臂支持鏡筒部分。鏡筒：上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，分為單筒和雙筒兩種。轉(zhuǎn)換器：是一個金屬圓盤，上面裝有3-4個物鏡，可以使物鏡通過鏡筒和目鏡組成一個放大系統(tǒng)。載物臺：放置鏡檢標本，中間有通光孔。載物臺上裝有標本夾和標本推進器，在推動器上具有刻度，能夠確定標本位置，便于找到觀察視野。調(diào)焦裝置：

調(diào)節(jié)物鏡與標本間距離的結(jié)構(gòu)。粗動螺旋微動螺旋2光學系統(tǒng)物鏡：安裝在轉(zhuǎn)換器上，將物體第一次放大，決定顯微鏡的成像質(zhì)量和分辨能力。目鏡：安裝在鏡筒上端，由兩塊透鏡組成，將物鏡成的像再次放大，但是不增加分辨力，目鏡放大倍數(shù)過大，反而影響觀察效果。聚光器：由聚光鏡和虹彩光圈組成，調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，使適當強度的光線照射到標本上。光源：安裝在鏡座內(nèi)，通過開關控制。濾光片：可見光由不同波長的光線組成，使用濾光片可以得到所需的一種波長的光線，提高分辨率、增加反差。一臺顯微鏡由機械裝置和光學系統(tǒng)組成，其中物鏡是顯微鏡最重要的部件。物鏡通常有三種，低倍鏡、高倍鏡、油鏡。低倍鏡的放大倍數(shù)一般為4-10×、高倍鏡的放大倍數(shù)一般為40-45×、油鏡為95-100×，是放大倍數(shù)最大的物鏡。㈡油鏡的工作原理1提高分辨率

0.5l最小可分辨距離=————

nsinq分辨率是決定顯微鏡觀察效果的重要指標，顯微鏡分辨率越高，能達到的最小可分辨距離越小。λ為所用光源波長；n=載玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。鏡口角是光線投射到物鏡上的最大角度，q為物鏡鏡口角半數(shù)，取決于物鏡的直徑和工作距離。

n：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。顯微鏡數(shù)值孔徑(numericalaperture,NA)：指鏡口角一半的正弦與載玻片物鏡間介質(zhì)折射率的乘積，是決定物鏡性能的最重要指標。空氣(n=1.0)、水(n=1.33)、香柏油(n=1.52)，介質(zhì)折射率提高數(shù)值孔徑值提高分辨率提高。

0.5l最小可分辨距離=————

nsinq光線在穿過折射率不同的介質(zhì)時發(fā)生折射。2提高照明度空氣(n=1.00)玻璃(n=1.52)很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。對于油鏡：工作介質(zhì)是香柏油?？諝?n=1.00)

玻璃(n=1.52)

香柏油(n=1.52)對于低倍鏡和高倍鏡：介質(zhì)是空氣㈢細菌的簡單染色細菌個體微小，無色透明，不經(jīng)過染色，常常不容易觀察。經(jīng)過染色后，菌體與背景顏色形成鮮明的顏色對比，便于在顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)、大小和排列方式。利用單一染料對菌體進行染色的方法稱為簡單染色。用于生物染色的堿性染料不是堿而是一種鹽，堿性染料電離時染料離子帶正電荷，而細菌蛋白質(zhì)的等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液時常帶負電荷，這樣帶負電荷的細菌很容易與帶正電荷的染料離子結(jié)合而使細菌著色。常用的堿性染料有美蘭、結(jié)晶紫、堿性復紅、番紅等。室溫或烘干1小滴生理鹽水四操作步驟㈠細菌的簡單染色涂片干燥固定染色水洗鏡檢2-3次美蘭，2-3min濾紙吸干㈡顯微鏡使用及細菌基本形態(tài)觀察1觀察前準備顯微鏡安置：置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約為10cm左右，鏡檢者姿勢要端正。光源調(diào)節(jié)：適當調(diào)節(jié)聚光器的高度可以改變視野亮度，但是一般情況下聚光器在使用中都是調(diào)到最高位置。調(diào)節(jié)目鏡間距和屈光度。聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)方法見教材，但是做普通觀察時可以不用調(diào)節(jié)。瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)：可以適應雙眼視力有差異的觀察者。2低倍鏡觀察養(yǎng)成良好的調(diào)焦習慣，先從側(cè)面注視，小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標本，然后用目鏡觀察，以防操作失誤而損壞鏡頭。3高倍鏡觀察一般情況下，當物像在一種物鏡中清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將其它物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，物像保持基本準焦狀態(tài)，稱為物鏡的同焦(parfocal)。利用同焦現(xiàn)象，在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數(shù)高、工作距離短的物鏡時，僅用微動螺旋即可對物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗動螺旋時可能的錯誤操作而損壞鏡頭。4油鏡觀察注意不要因為在下降物鏡鏡頭時用力過猛或者調(diào)焦時誤將粗動螺旋向反方向轉(zhuǎn)動而損壞鏡頭及載玻片。不可以將高倍鏡轉(zhuǎn)動經(jīng)過加油鏡油的區(qū)域。5顯微鏡用畢后處理下降載物臺，取下載玻片；分三步用擦鏡紙清理鏡頭。將顯微鏡還原。包括將光源燈亮度調(diào)至最低后關閉；將最低放大倍數(shù)物鏡轉(zhuǎn)到工作位置；載物臺及聚光器降至最低位置。五注意事項

1嚴格、標準的進行無菌操作。