環(huán)境生物學(xué)課件遺傳工程原理與應(yīng)用

1.生物降解的局限性(1）沒有一種微生物可以降解所有的有機污染物(2）污染物包含各種化學(xué)物質(zhì)，一種微生物也許只能降解混合物的一種成分，而且可能受到別的成分抑制(3)在某些惡劣條件下，微生物難以有效降解污染物(4）許多非極性的化合物可能會吸附在土壤和沉淀物上,使生物難以降解(5）有些高濃度有機化合物可以抑制微生物的降解活性或生長第八章：遺傳工程原理及其在生物降解中的應(yīng)用基因操作是解決上述問題的可能途徑！！2.DNA重組技術(shù)原理重組DNA技術(shù)，是達成基因信息（DNA）在生物體之間轉(zhuǎn)移的一系列實驗流程的簡稱(圖1）。多種方法可以達到基因轉(zhuǎn)移的目的。重組DNA實驗通常遵循以下程序:1.供體DNA經(jīng)抽提、酶切、連接到另一個DNA載體（質(zhì)粒）上，形成一種新的重組DNA分子2.構(gòu)建體轉(zhuǎn)入宿主細胞。將DNA導(dǎo)入一個宿主細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化3.經(jīng)過鑒定選出含有DNA構(gòu)建體的宿主細胞（稱為轉(zhuǎn)化子）4.構(gòu)建體在宿主細胞中表達所需的蛋白質(zhì)

圖2.可同時降解樟腦、辛烷、二甲苯、萘的菌株的構(gòu)建含有降解樟腦質(zhì)粒的菌株A，與含有降解辛烷質(zhì)粒的菌株B接合，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并發(fā)生同源重組，產(chǎn)生一個帶有降解樟腦和辛烷的融合質(zhì)粒的菌株E。含有降解二甲苯質(zhì)粒的菌株C，與含有降解萘質(zhì)粒的菌株D接合，產(chǎn)生一個帶有降解二甲苯質(zhì)粒和降解萘質(zhì)粒的菌株F。菌株E和F接合產(chǎn)生一個菌株G，它攜帶有一個降解樟腦和辛烷的融合質(zhì)粒，一個降解二甲苯質(zhì)粒和一個降解萘質(zhì)粒。3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移（1）混合污染物的降解（2）低溫環(huán)境中的生物降解

大多數(shù)通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進行基因操作的具有降解性能的細菌是嗜溫細菌，這些微生物只有在20℃～40℃才可以良好生長。但是被污染的河流、湖泊、海洋通常只有0～20℃。

一種從嗜溫性菌株惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)中的ToL(降解甲苯)質(zhì)粒通過接合作用轉(zhuǎn)入一種耐寒的，并可在0℃時降解水楊酸的惡臭假單胞菌種。轉(zhuǎn)化后該菌可同時在低溫下降解水楊酸和甲苯。

轉(zhuǎn)化株攜帶有轉(zhuǎn)入的TOL質(zhì)粒和它自身的SAL質(zhì)粒（降解水楊酸），可以在0℃時利用水楊酸或者甲苯作為唯一的碳源(表1)，而野生型(未轉(zhuǎn)化)的耐寒惡臭假單孢菌在以甲苯作為唯一碳源的條件下，任何溫度都不能生長

表1.不同溫度下以水楊酸或甲苯為唯一碳源時野生型（非轉(zhuǎn)化）和轉(zhuǎn)化的耐寒惡臭假單孢菌P.putida的傳代時間

溫度（℃）傳代時間野生型+水楊酸轉(zhuǎn)化子+水楊酸轉(zhuǎn)化子+甲苯37沒有生長沒有生長沒有生長302.22.52.0252.13.21.3202.63.81.9153.24.22.9106.35.63.3513.912.912.2018.618.124.4（3）放射環(huán)境中的有機污染物降解射線對大多數(shù)微生物細胞都具有殺滅作用,因此在放射環(huán)境中處理有機物染物的細菌必須具有抗射線的能力.非致病土壤細菌耐輻射球菌Deinococcusradiodurans對高水平的放射有天然抵抗作用。這種抵抗作用歸功于其對DNA的修復(fù)能力，它對于DNA損傷的修復(fù)非常有效。而且，任何導(dǎo)入該耐輻射球菌的外源DNA，不管是以質(zhì)粒的形式還是插入到染色體上，都能抵抗高劑量的輻射。由于這種細菌能在持續(xù)放射性污染物的有毒環(huán)境中表達生物清除蛋白,因此是理想的候選細菌。圖3顯示了Deinococcusradiodurans對放射線的抵抗能力。

圖3.γ射線對大腸桿菌和耐輻射球菌的影響4.降解酶在細胞表面的表達細菌表達的降解酶一般都是在胞內(nèi)的,而細胞對某些目標(biāo)底物(特別是一些非極性物質(zhì))的攝入速率是很慢，因而降解速率也相對較慢，而利用純化的酶來催化底物降解與去毒化作用，成本則過于昂貴。因而，人們建立了一種新的方法來解決這一問題。通過對大腸桿菌的工程化處理，使有機磷水解酶在細菌外表面表達，成為含大腸桿菌脂蛋白信號肽和脂蛋白N端部分以及外膜的蛋白A的融合蛋白的一部分(圖6,7)。這樣，就可以解決細菌攝取殺蟲劑速率過慢的問題。定位于細胞膜表面的有機磷水解酶的細菌降解活性是胞內(nèi)表達相同量的7倍，而且酶活性相當(dāng)穩(wěn)定。37℃下100%活性可以保持1個月。

圖5.定位于細胞膜表面的有機磷水解酶示意圖該酶暴露于環(huán)境中并具有有機磷水解酶活性。Lpp包括大腸桿菌脂蛋白N端前9個氨基酸。OmpA包括外膜蛋白A的跨膜區(qū)（氨基酸46-159）。OPD包括產(chǎn)黃菌屬FlavobacteriumSPP.的有機磷水解酶基因及其信號肽。圖4.產(chǎn)生融合蛋白Lpp-OmpA-OPD的DNA構(gòu)建體構(gòu)建體含有大腸桿菌lac啟動子，大腸桿菌脂蛋白信號肽lpp和脂蛋白N端前9個氨基酸，外膜蛋白A的跨膜區(qū)，以及產(chǎn)黃菌屬FlavobacteriumSPP.的有機磷水解酶基因及其信號肽。5.抗有機溶劑萃取效應(yīng)的微生物當(dāng)廢水中有機溶劑含量較高時會對微生物細胞造成傷害，影響其降解能力。因為細胞膜的主要成分是磷脂、脂蛋白和脂多糖等，而有機溶劑可以不同程度地溶解這些物質(zhì)，從而破壞細胞膜，使細胞失去活性。因此處理含有機溶劑廢水的微生物必須是對有機溶劑具有抗性的微生物菌種。人們早就注意到一個現(xiàn)象，即發(fā)酵法生產(chǎn)有機溶劑（如丙酮，醋酸丁脂等）的菌種對有機溶劑具有天然的抵抗力。但人們早期并不知道其所以然。近來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已闡明了其分子機理。

能抵抗有機溶劑萃取作用的微生物有一種酶，它可以將細胞膜中的順式脂肪酸轉(zhuǎn)變成反式脂肪酸。反式脂肪酸組成的脂類物質(zhì)具有非常穩(wěn)定的空間構(gòu)相，不易被有機溶劑破壞，但脂肪酸的生物化學(xué)性質(zhì)仍然存在，所以這種微生物在含有有機溶劑的環(huán)境中細胞膜還能保持完整的結(jié)構(gòu)。這就保證了細胞在抵抗有機溶劑的同時還具有細胞的一切生物活性。這種酶一般是組成型的，即在細胞質(zhì)中一直存在，但平