分子診斷-xyz核酸雜交

第四章核酸分子雜交技術(shù)

(nucleicacidhybridization)張效云目的掌握核酸分子雜交的基本原理，核酸探針的種類(lèi)、標(biāo)記物和標(biāo)記方法;熟悉Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、斑點(diǎn)或狹縫雜交、菌落雜交和組織或細(xì)胞原位雜交的基本原理及特點(diǎn)，探針的純化和檢測(cè);了解液相雜交的幾種基本方法。核酸分子雜交

(nucleicacidhybridization)利用核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理一、核酸變性（denaturation）1、核酸變性:是指在某些理化因素的作用下，DNA雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，形成單鏈的過(guò)程。常用的變性方法：加熱檢測(cè)DNA變性方法：260nm紫外吸收值DNA變性后，260nm紫外吸收值增加。常用變性方法

(1)熱變性當(dāng)溫度＜70℃，DNA幾乎不變性；當(dāng)溫度介于70～90℃時(shí)，DNA部分變性；當(dāng)溫度＞90℃，DNA完全變性；當(dāng)溫度＞100℃，DNA雙鏈分離；通常核酸的變性溫度可選在90～100℃之間。(2)酸堿變性當(dāng)核酸溶液的pH低于3或高于10時(shí)，核酸的雙鏈可以完全打開(kāi)成為單鏈核酸分子；在分子雜交中最常用的核酸變性方法是堿變性（因?yàn)楹怂岬妮d體物如凝膠或膜對(duì)熱不穩(wěn)定）(3)化學(xué)試劑變性當(dāng)核酸溶液中含有一定濃度的化學(xué)試劑如尿素、甲酰胺、甲醛、胍等時(shí)，雙鏈間的氫鍵可以斷裂形成單鏈核酸分子DNA變性過(guò)程示意圖Tm值：熱變性過(guò)程中DNA變性一半所需要的溫度稱為融解溫度（meltingtemperature,Tm）。DNA的Tm值一般在82℃~95℃之間。DNA的Tm值大小與下列因素有關(guān)：1.DNA的均一性2.堿基組成3.溶液的離子強(qiáng)度4.pH值5.變性劑

6.雜交鏈長(zhǎng)度二、核酸復(fù)性當(dāng)變性條件緩慢去除后，兩條彼此分開(kāi)的互補(bǔ)單鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為DNA復(fù)性（renaturation）。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱之為退火(annealing)

DNA復(fù)性后，260nm紫外吸收值降低

復(fù)性速度一般可以用Cot1/2來(lái)衡量，Co是單鏈DNA的起始濃度(mol/L)，t為時(shí)間，以s表示。Cot1/2表示單鏈DNA的起始濃度與復(fù)性一半所需時(shí)間之積（mol.s/L），與復(fù)性速率成反比，Cot1/2增大意味著反應(yīng)速度變慢。影響DNA復(fù)性速度的因素1.DNA的分子大小和復(fù)雜度2.離子強(qiáng)度3.DNA的濃度4.溫度

第二節(jié)核酸探針探針（probe）廣義上指的是能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被某些方法所檢測(cè)的分子。核酸探針是指能與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補(bǔ)結(jié)合，并可用特殊方法檢測(cè)的被標(biāo)記的已知核酸序列。一、核酸探針的種類(lèi)基因組DNA探針：是目前最常用的核酸探針。cDNA探針：指以mRNA為模板經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補(bǔ)于mRNA的DNA分子RNA探針：RNA分子大多以單鏈形式存在，與靶序列的雜交效率明顯提高。寡核苷酸探針：長(zhǎng)度一般為20～50nt，雜交效率較高。

基因組DNA探針從基因組DNA文庫(kù)中選取某一基因片段

↓

與載體連接（質(zhì)粒、噬菌體）

↓

克隆(PCR擴(kuò)增)

↓

酶切

優(yōu)點(diǎn)：①無(wú)限繁殖、制備方法簡(jiǎn)單；②不易降解（與RNA比較）；③標(biāo)記方法成熟。cDNA探針（complementaryDNA）

↓S1核酸酶切平兩端優(yōu)點(diǎn)：不含內(nèi)含子及高度重復(fù)序列↓克隆通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄加接頭 ↓限制酶粘性末端↓

雙鏈cDNA

↓

載體連接優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性 雜交較少,未雜交探針可用RNase 降解，減少本底的干擾。

缺點(diǎn)：易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜

RNA探針：檢測(cè)DNA和mRNA寡核苷酸探針特點(diǎn)：①根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要合成相應(yīng)的核酸序列，從而避免天然探針的缺陷；②寡核苷酸探針長(zhǎng)度一般為20nt~50nt，序列短而簡(jiǎn)單，所以與等量靶分子完全雜交的時(shí)間比其它探針短；③寡核苷酸探針可以識(shí)別靶分子中單個(gè)堿基的變化，可用于點(diǎn)突變的檢測(cè)；④特異性不高，雜交信號(hào)不強(qiáng)，需要精心設(shè)計(jì)非常特異的寡核苷酸探針。寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則①探針長(zhǎng)度在20nt~50nt為宜②堿基成分G+C含量在40％~60％為宜③探針?lè)肿又胁粦?yīng)存在大于4bp的互補(bǔ)序列④避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)多于4次⑤與非靶基因同源性不應(yīng)超過(guò)70％或有連續(xù)8個(gè)以上堿基同源二、核酸探針的標(biāo)記理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特征：①高靈敏度；②標(biāo)記物與探針結(jié)合后，絕對(duì)不影響堿基配對(duì)的特異性、雜交體的穩(wěn)定性及其Tm值；③檢測(cè)方法應(yīng)高度靈敏、特異，假陽(yáng)性率低；④標(biāo)記物與探針結(jié)合后穩(wěn)定、保存時(shí)間長(zhǎng);⑤標(biāo)記物對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低廉。

核酸探針的標(biāo)記

標(biāo)記物核素標(biāo)記物（同位素標(biāo)記）：32P、35S、125I等非核素標(biāo)記物（非同位素標(biāo)記）：生物素、地高辛、熒光素等：32P優(yōu)點(diǎn)：放射比活度高缺點(diǎn)：半衰期短（14.3D）、散射嚴(yán)重35S優(yōu)點(diǎn)：分辨率較高，半衰期長(zhǎng)（87.1D）放射比活度高缺點(diǎn)：放射比活度只有32P的1/63H優(yōu)點(diǎn)：半衰期長(zhǎng)（12.3Y）、成像分辨率高，易于定位缺點(diǎn)：活性低,污染環(huán)境放射性同位素的選擇32P或35S同位素標(biāo)記的單核苷酸（α）（γ）（OH）HOH標(biāo)記方法探針標(biāo)記體內(nèi)(invivo)標(biāo)記法體外(invitro)標(biāo)記法（常用）

化學(xué)法

酶法切口平移法

隨機(jī)引物法

基因組DNA探針（一）放射性核素標(biāo)記探針標(biāo)記方法切口平移法(nicktranslation)隨機(jī)引物法(randomprimer)末端標(biāo)記法PCR標(biāo)記法體外轉(zhuǎn)錄法1.切口平移法（nicktranslation）特點(diǎn):

快速、簡(jiǎn)便、標(biāo)記比活性均一?；驹?

利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的dNTP摻入到新合成的DNA鏈中,從而獲得高比活性的DNA探針。適用范圍:

適用于各種dsDNA的標(biāo)記,不適于

ssDNA或RNA探針的標(biāo)記。注意事項(xiàng)①本法必須采用大腸桿菌DNA聚合酶全酶；②標(biāo)記物需標(biāo)記在核苷酸的α-磷酸位上；③DNaseI的濃度控制非常重要。④放射性核素的比活性一般要求≥2.96×1013Bq/mmol，通常1μgDNA加入3.7×1012Bq核素可標(biāo)記至1×108cpm；⑤一般1μgDNA加入DNA聚合酶5U~20U為宜；⑥用純化的DNA片段往往能得到特異性較強(qiáng)的探針。2.隨機(jī)引物法(randompriming)特點(diǎn)：結(jié)果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便,合成的探針比活性高（顯著高于切口平移法）。適用范圍：既適用于dsDNA分子標(biāo)記,又可用于ssDNA和RNA探針的標(biāo)記。

隨機(jī)引物法是一種較為理想的核酸探針標(biāo)記方法，有取代切口平移法的趨勢(shì)。注意事項(xiàng)①加入隨機(jī)引物的量不要過(guò)多，否則探針的標(biāo)記長(zhǎng)度會(huì)過(guò)短。一般標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度為200bp~400bp，已能基本滿足各種雜交實(shí)驗(yàn)的需要；②當(dāng)單鏈DNA或RNA作為模板時(shí)，采用本法標(biāo)記的產(chǎn)物是模板的互補(bǔ)鏈。3.末端標(biāo)記法

①3‘-末端標(biāo)記法

Klenow大片段的末端標(biāo)記法②5'-末端標(biāo)記法ALP5'-pCpGpTpAp···CpCpTpG-3'5'-HO-CpGpTpAp···CpCpTpG-3'5'-32pCpGpTpAp···CpCpTpG-3'PNKT4噬菌體多核苷酸激酶標(biāo)記法DNA探針的末端標(biāo)記法對(duì)DNA探針的5’或3’末端進(jìn)行部分標(biāo)記，而不是對(duì)其全長(zhǎng)標(biāo)記；標(biāo)記比活性不高，標(biāo)記物分布不均勻.不足這種標(biāo)記方法可得到全長(zhǎng)DNA片段，主要用于DNA序列測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。優(yōu)勢(shì)4.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）標(biāo)記法5.體外轉(zhuǎn)錄法

①SP6RNA聚合酶體系②成對(duì)啟動(dòng)子系列（二）非放射性標(biāo)記酶促反應(yīng)標(biāo)記法化學(xué)修飾標(biāo)記法方法

標(biāo)記物:

生物素,熒光素,地高辛,光敏生物素,酶（1）生物素標(biāo)記

用生物素標(biāo)記dNTP或NTP，再利用切口平移法或隨機(jī)引物法將它們摻入到DNA鏈中。eg:Bio-16-UTP,Bio-7-dATP2．光敏生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行;成本低;探針?lè)€(wěn)定,靈敏度高;

適用范圍廣(DNAorRNA)3.地高辛標(biāo)記

將地高辛標(biāo)記在dUTP上形成dig–11-dUTP，摻入到核酸分子中。優(yōu)點(diǎn):

不受半衰期限制,可保存時(shí)間長(zhǎng),與biotin探針相比,靈敏度更高,特異性更強(qiáng);檢測(cè)產(chǎn)物顏色鮮亮,背景干擾小。4.酶標(biāo)記

堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)或辣根過(guò)氧化物酶(herseradishperoxidase，HRP)

常用HRP-對(duì)苯醌-聚乙烯亞胺酶標(biāo)DNA體系5.熒光素標(biāo)記

常用的熒光素主要有異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC），或羅丹明（rhodamine）三、核酸探針的純化（一）乙醇沉淀法（二）凝膠過(guò)濾層析法

凝膠柱色譜法反相柱色譜法微柱離心法四、核酸探針的檢測(cè)(一)放射性核素探針的檢測(cè)

放射自顯影液閃計(jì)數(shù)法

（二）非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)

偶聯(lián)反應(yīng)堿性磷酸酶顯色反應(yīng)示意圖顯色反應(yīng)1.酶促顯色法2.熒光法3.化學(xué)發(fā)光法常用的免疫酶學(xué)檢測(cè)方法有兩類(lèi)：（1）ALP顯色體系A(chǔ)LP以BCIP/NBT（5-溴-4氯-3吲哚磷酸/硝基四氮唑藍(lán)）為底物，顯示結(jié)果為藍(lán)紫色。（2）HRP顯色體系以DAB（四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺）/H2O2為底物，結(jié)果為棕色；或以4C1N（4-氯-1-萘酚）/H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明等。FITC的最大吸收光波長(zhǎng)為490nm~495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520nm~530nm，呈明亮的黃綠色熒光，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。四乙基羅丹明最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595nm~600nm，呈橘紅色熒光，常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。?-1常用核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)第三節(jié)核酸分子雜交的影響因素1.探針的濃度和長(zhǎng)度2.雜交的溫度3.雜交液的離子強(qiáng)度和甲酰胺濃度4.雜交率5.洗滌條件6.促進(jìn)劑第四節(jié)核酸分子雜交的類(lèi)型液相雜交：是將待測(cè)核酸樣品和核酸探針同時(shí)置于雜交液中進(jìn)行反應(yīng)。固相雜交：將待測(cè)的核酸樣品預(yù)先固定于固體支持物上，然后放入含有標(biāo)記探針的雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，在支持物上檢測(cè)雜交結(jié)果4-2各種固相雜交方法的檢測(cè)目的Southern印跡雜交1975年，英國(guó)Southern創(chuàng)建檢測(cè)目的：Southern印跡（Southernblot）雜交是一種膜上檢測(cè)DNA的雜交技術(shù)，用于基因組DNA的定性及定量分析、DNA圖譜分析、基因變異、RFLP分析及疾病診斷等。提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization

檢測(cè)靶分子為DNA,檢測(cè)靶分子是否含有目的基因。可用于基因組基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。預(yù)雜交表4-3NC膜和尼龍膜的性能比較

常見(jiàn)的固相支持物

硝酸纖維素膜（nitrocellulosefiltermembrane）尼龍膜（nylonmembrane）化學(xué)活化膜：聚氟偏乙烯膜（PVDF膜）乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。Southern轉(zhuǎn)膜方法毛細(xì)管虹吸印跡法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管印跡示意圖DNA片段<1kb，1小時(shí)；DNA片段>15kb，18小時(shí)電轉(zhuǎn)移法注意：1.不宜用硝酸纖維素膜；2.應(yīng)有冷卻裝置一般2~3小時(shí)，最多6~8小時(shí)

真空轉(zhuǎn)移法需30~60分鐘預(yù)雜交（prehybridization）1．概念：為了減少探針與膜等的非特異性結(jié)合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點(diǎn)封閉，該過(guò)程稱為預(yù)雜交。2．常用的封閉物：（1）變性的非特異性DNA，如鮭魚(yú)精子DNA、小牛胸腺DNA，又稱為覆蓋DNA。（2）高分子化合物：一般常用Denhardt’s溶液，包括聚乙烯吡咯烷酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400預(yù)雜交：雜交袋，42℃或68℃水浴，輕微振蕩4-12小時(shí)預(yù)雜交液：6×SSC、0.5%SDS、5×Denhardt’s液、100μg/ml變性的鮭魚(yú)精子DNA。雜交：雜交袋，42℃或68℃水浴，輕微振蕩雜交液：6×SSC、0.5%SDS、5×Denhardt’s液、100μg/ml變性的鮭魚(yú)精子DNA、變性的探針。洗膜：取出雜交膜，按先高鹽后低鹽溶液進(jìn)行漂洗。室溫，2×SSC、0.1%SDS中洗膜2次/15分鐘，輕微振蕩；

68℃，0.2×SSC、0.1%SDS中洗膜2次/10分鐘，輕微振蕩；洗去未結(jié)合的、游離的探針，可能非特異性結(jié)合的DNA2.不需要限制性核酸酶切;3.變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法；4.印跡前將含變性劑的凝膠用水浸泡除去后再印跡、雜交。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，或比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。Northernblottinghybridization

1977年，Alwine創(chuàng)建，檢測(cè)靶分子為RNA與SouthernBlot不同的是：

1.RNA極易被環(huán)境中存在的RNase降解，提取時(shí)要特別注意RNase污染問(wèn)題；①提取組織總RNA作為檢測(cè)樣品；②變性電泳；③轉(zhuǎn)膜；④預(yù)雜交；⑤Northern雜交；⑥雜交分子檢測(cè)；⑦結(jié)果分析。Northern印跡雜交的基本步驟

直接將變性DNA、RNA樣品點(diǎn)于NC膜上，固定好后先預(yù)雜交，再與探針雜交。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品

缺點(diǎn)：無(wú)法判斷片段的大小。

應(yīng)用：多用于核酸定性或半定量分析，便于雜交條件的摸索。dotandslotblottinghybridization菌落雜交菌落原位雜交技術(shù)原位雜交

(insituhybridization)概念：將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。特點(diǎn)：1.能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究；2.不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高；3.能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。

探針與分裂中期染色體DNA雜交，研究染色質(zhì)中特定核酸序列在染色體中的精確定位；探針與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交，觀察該組織細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平；用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行雜交，確定有無(wú)該病原體的感染。應(yīng)用：核酸原位雜交的基本步驟玻片清洗細(xì)胞或組織的固定：載玻片組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記預(yù)雜交和雜交雜交結(jié)果檢測(cè)