重組體的選擇與鑒定

關(guān)于重組體的選擇與鑒定第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日何為重組體？轉(zhuǎn)化子：在DNA分子克隆中，通常將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子；重組體：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子；目的重組體：含有外源目的基因的重組體。第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日為什么要對(duì)重組子進(jìn)行選擇與鑒定在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中,并非所有的細(xì)胞中都轉(zhuǎn)入重組DNA分子,即使所有的受體細(xì)胞都變?yōu)檗D(zhuǎn)化體,所獲得的轉(zhuǎn)化子仍是多種類型的DNA分子,因?yàn)樵谶B接反應(yīng)中會(huì)有以下幾種情況發(fā)生:載體和一個(gè)或數(shù)個(gè)串聯(lián)目的基因連接載體發(fā)生自連目的DNA分子發(fā)生自連未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片段第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日為什么要對(duì)重組子進(jìn)行選擇與鑒定因此,在成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)化子中，真正含有期望的重組DNA分子的比例很少，為了將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA的宿主細(xì)胞分開，以及將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開，就需要設(shè)計(jì)出最易于篩選重組子的方案并加以驗(yàn)證。第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日常用的選擇方法第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日直接選擇法第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日遺傳學(xué)表型篩選方法一—抗藥性篩選分類：（1）抗藥性基因不失活（2）抗藥性基因失活常用的抗藥性選擇標(biāo)記：氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）

卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet或Tc）

鏈霉素（Sm或Str）第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因不失活基本原理：外源基因片段插入載體的位點(diǎn)在抗藥性基之外，不導(dǎo)致抗藥性基因的失活，仍能編碼抗藥性基因產(chǎn)物。含有這種重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長(zhǎng)成菌落，未能接受載體DNA的細(xì)胞因不能生長(zhǎng)而被排除。第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因不失活實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基中加入千分之一的抗性藥物，再倒平板；（2）將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在平板上；（3）放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16小時(shí)；（4）觀察菌落生長(zhǎng)情況。第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因不失活第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因失活基本原理：如果外源基因片段插入載體的位點(diǎn)在抗藥性基因中間，導(dǎo)致抗藥性基因失活，這個(gè)抗藥性標(biāo)志就會(huì)失活。檢測(cè)外源DNA插入作用的一種通用的方法是插入失活效應(yīng)。第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因失活例如：非重組的pBR322質(zhì)粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的。帶有這種質(zhì)粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長(zhǎng)。但是,如果在該質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因內(nèi)插入外源片段,就會(huì)造成氨芐青霉素抗性基因失活,攜帶這種質(zhì)粒的宿主菌可以在四環(huán)素的平板上生長(zhǎng),而不能在氨芐青霉素抗性平板上生長(zhǎng)。第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因失活第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日抗藥性基因失活注意事項(xiàng)：（1）以Amp、Tc等抗生素作為選擇藥物時(shí)，37℃培養(yǎng)時(shí)間約12~16h，超過時(shí)間視為雜菌（假轉(zhuǎn)化子菌落）。（2）挑選單菌落作為轉(zhuǎn)化子以便進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。挑的菌落在培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法基本原理：許多質(zhì)粒載體具有β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)的檢測(cè)功能。

當(dāng)外源DNA插入到它的lacZ基因（編碼β-半乳糖苷酶）上時(shí)，可造成β-半乳糖苷酶的失活，就可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在添加X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色變化鑒別出重組子和非重組子。（X-gal是β-半乳糖苷酶的顯色底物）第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法

舉例：pUC質(zhì)粒：帶有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多種限制性核酸酶單一識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，但并沒有破壞lacZ的閱讀框架。大腸桿菌菌株：帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下，pUC質(zhì)粒和大腸桿菌編碼的β-半乳糖苷酶片段都沒有活性。第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日

遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,可形成具有酶活性的蛋白質(zhì),它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pUC質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后，則會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變，表達(dá)蛋白失活，因此，在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。因此，根據(jù)這種β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，可將重組質(zhì)粒與自身環(huán)化的載體DNA分開。第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日遺傳學(xué)表型篩選方法二

β-半乳糖苷酶顯色法注意事項(xiàng)：（1）由于被轉(zhuǎn)化的基因產(chǎn)物作用于X-gal需要較長(zhǎng)時(shí)間，因此，觀察和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。與37℃溫箱取出后放4℃冰箱幾小時(shí)后觀察效果更好；（2）為了防止假陽性需挑菌進(jìn)一步驗(yàn)證。第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日間接選擇法第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法之一快速裂解菌落鑒定分子大小基本原理：由于外源片段插入的重組質(zhì)粒與載體大小不同，故可以利用瓊脂糖凝膠電泳將重組體分離出來。第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法之一

快速裂解菌落鑒定分子大小優(yōu)點(diǎn)：直觀快捷，適用于插入片段較大的重組子的篩選。缺點(diǎn)：不能鑒別插入片段大小相近的非目的基因片段。第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法二

——限制性內(nèi)切酶酶切法基本原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA的帶數(shù)和長(zhǎng)度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切這個(gè)片段，電泳后比較電泳結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法二

——限制性內(nèi)切酶酶切法第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法三

PCR法基本原理：在載體DNA分子中，外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列多為已知，通過與插入位點(diǎn)兩側(cè)已知序列互補(bǔ)的引物，從單克隆中提取少量質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析確定是否為重組子。第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法三

PCR法注意事項(xiàng)：如需檢測(cè)插入片段及其方向，則使用載體特異引物和方向插入特異引物或互換。如只需確認(rèn)是否存在插入片段，可用2個(gè)插入片段特異引物。

擴(kuò)增反應(yīng)前在94℃變性兩分鐘，有利于細(xì)菌的裂解，提高PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的成功。第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法四

菌落雜交篩選主要原理

用體外標(biāo)記基因DNA或相應(yīng)的RNA為探針同轉(zhuǎn)化后的菌落進(jìn)行原位雜交，篩選含重組DNA的克隆。這個(gè)方法可以快速地從數(shù)百個(gè)菌落中挑選出含有重組DNA的克隆。該方法的優(yōu)點(diǎn)是通用性比較強(qiáng)，可以用來檢測(cè)任何一種插入的DNA序列。這種方法依據(jù)的是核酸分子雜交的原理，而不以插入的DNA序列能否實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)為前提，因此，只要有可利用的標(biāo)記探針就可檢測(cè)出重組質(zhì)粒DNA。第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日總