過程中常見問題及處理方法演示文稿

過程中常見問題及處理方法演示文稿第一頁，共三十六頁。過程中常見問題及處理方法第二頁，共三十六頁。WB的簡介WB即蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

第三頁，共三十六頁。

基本原理通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。第四頁，共三十六頁。

應(yīng)用1.目的蛋白的表達特性分析2.目的蛋白與其它蛋白的互作3.目的蛋白的組織定位4.目的蛋白的表達量分析第五頁，共三十六頁。第六頁，共三十六頁。第七頁，共三十六頁。第八頁，共三十六頁。三、WB的影響因素步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果1、電泳分離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備變性；上樣量；電泳（電壓、電流的大小，膠濃度、制膠）第九頁，共三十六頁。2、轉(zhuǎn)膜膜的選擇；膜的確認；特殊處理；……第十頁，共三十六頁。3、封閉封閉液的選擇；封閉條件優(yōu)化；……第十一頁，共三十六頁。4、漂洗漂洗液的配制與選擇漂洗時間及次數(shù)第十二頁，共三十六頁。5、抗體孵育抗體及稀釋液選擇；抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化；抗體孵育時間；……第十三頁，共三十六頁。6、曝光曝光時間的掌控第十四頁，共三十六頁。四、注意事項1.蛋白樣品的提取盡可能新鮮組織或蛋白避免反復(fù)凍融對于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF）盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）

選擇合適的裂解液準確定量（BSA標準蛋白）

第十五頁，共三十六頁。第十六頁，共三十六頁。2、制膠根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。第十七頁，共三十六頁。

制膠的時候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。玻璃板底部放平，盡量不能漏膠灌膠的時候，不能太快，容易產(chǎn)生旋窩水或異丙醇壓的時候，不能太久第十八頁，共三十六頁。

3、轉(zhuǎn)膜a泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液浸泡20min；

凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化第十九頁，共三十六頁。c膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板，不能放反d轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻e具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短f避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。第二十頁，共三十六頁。g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉(zhuǎn)膜不完全h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率i一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景第二十一頁，共三十六頁。4、封閉

a脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素

b如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化c檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑第二十二頁，共三十六頁。5、孵育a洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效價問題第二十三頁，共三十六頁。五、常見問題及解決電泳中的問題︶條帶呈笑臉狀——凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;——電泳系統(tǒng)溫度偏高第二十四頁，共三十六頁。︵條帶呈皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全第二十五頁，共三十六頁。

拖尾樣品溶解不好第二十六頁，共三十六頁。紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒第二十七頁，共三十六頁。條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜第二十八頁，共三十六頁。條帶兩邊擴散加樣量過多第二十九頁，共三十六頁。

Westernblot結(jié)果曝光問題

背景過高且不均勻1、封閉不充分——延長封閉時間；——更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）

2、一抗?jié)舛冗^高——增加一抗稀釋倍數(shù)；

3、抗體孵育溫度過高——4℃孵育第三十頁，共三十六頁。4、二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)——設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?、洗膜不充分——增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù)第三十一頁，共三十六頁。沒有陽性條帶或很弱1、一抗、二抗等不匹配訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設(shè)置內(nèi)參可以驗證二級測系統(tǒng)的有效性更換更好的一抗二抗第三十二頁，共三十六頁。2、一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度；長孵育時間；第三十三頁，共三十六頁。3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠）第三十四頁，共三十六頁。4、樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至