第1.1節(jié)：DNA重組技術(shù)的基本工具

第1.1節(jié)DNA重組技術(shù)的基本工具專題一：基因工程基因工程的產(chǎn)物：多彩小魚轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小豬辣椒香蕉藍(lán)色玫瑰黑籽番茄藍(lán)色妖姬基因工程的產(chǎn)物：藍(lán)色妖姬的產(chǎn)生藍(lán)色素基因三色紫羅蘭白玫瑰導(dǎo)入知新目的基因受體細(xì)胞技術(shù)：基因工程基因工程的概念

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。基因工程的別名__________________操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象____________操作水平__________________操作過程__________________實(shí)質(zhì)____________結(jié)果DNA重組技術(shù)/基因拼接技術(shù)基因DNA分子水平基因重組剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)新的生物類型和生物產(chǎn)品科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律早期基礎(chǔ)理論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。早期基礎(chǔ)理論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程艾弗里證明DNA是主要遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。早期基礎(chǔ)理論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。早期基礎(chǔ)理論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制早期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論科技探索之路：技術(shù)發(fā)明使基因工程的實(shí)施成為可能1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。普通棉花抗蟲棉想一想：完成抗蟲棉的培育，需要哪些關(guān)鍵工作？基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：普通棉花(無抗蟲特性)提取抗蟲基因通過運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體思考：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子手術(shù)刀”——“分子縫合針”——“分子運(yùn)輸車”——限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體DNA重組技術(shù)的基本工具(1)“分子手術(shù)刀”——(2)“分子縫合針”——(3)“分子運(yùn)輸車”——

DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體限制性核酸內(nèi)切酶(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具1．來源：2．特點(diǎn)：3．作用：4．結(jié)果：主要是從

中分離純化出來的。原核生物識(shí)別雙鏈DNA分子的某種________________。切割特定核苷酸序列中的特定位點(diǎn)。具有專一性。特定核苷酸序列斷開每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的____________（化學(xué)鍵）。磷酸二酯鍵產(chǎn)生______末端或____末端。黏性平(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具1’2’3’4’5’復(fù)習(xí)：脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具復(fù)習(xí)：磷酸二酯鍵G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯鍵3’端5’端3’端5’端(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具限制酶的識(shí)別序列24仔細(xì)觀察各限制酶的識(shí)別序列有何特點(diǎn)？限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列

不同的限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列。(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。例如：EcoRⅠ內(nèi)切酶(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具

黏性末端黏性末端

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。例如：EcoRⅠ內(nèi)切酶(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具例如：SmaⅠ內(nèi)切酶SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線在G與C之間切割(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA重組技術(shù)的基本工具例如：SmaⅠ內(nèi)切酶平末端平末端當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。DNA重組技術(shù)的基本工具(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。DNA重組技術(shù)的基本工具(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

通過長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。DNA重組技術(shù)的基本工具(1)、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”酶作用限制酶DNA水解酶DNA解旋酶限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶、DNA解旋酶的區(qū)別將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.切割磷酸二酯鍵，形成單個(gè)的脫氧核糖核苷酸。DNA重組技術(shù)的基本工具(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”

把被限制酶切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將兩個(gè)脫氧核糖核苷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵。1．作用：DNA重組技術(shù)的基本工具(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”

把被限制酶切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將兩個(gè)脫氧核糖核苷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵。1．作用：

兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來例如：E·coliDNA連接酶DNA重組技術(shù)的基本工具(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”2．種類：大腸桿菌互補(bǔ)的黏性末端噬菌體黏性末端平末端連接平末端需要用什么連接酶？T4DNA連接酶DNA重組技術(shù)的基本工具(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”E.coliDNA連接酶：只能連接黏性末端之間。T4DNA連接酶：既連接黏性末端，又連接平末端。例如：T4DNA連接酶DNA重組技術(shù)的基本工具(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”形成重組DNA分子。3．結(jié)果：……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合（E.coliDNA連接酶）同一種內(nèi)切酶（EcoRⅠ內(nèi)切酶）……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……DNA重組技術(shù)的基本工具(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”限制酶與DNA連接酶的關(guān)系：

①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。②DNA連接酶起作用時(shí)不需要模板。DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：DNA重組技術(shù)的基本工具DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象

作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵

在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵(2)、DNA連接酶——“分子縫合針”DNA重組技術(shù)的基本工具(3)、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”①作為運(yùn)載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)；②利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。1.載體的作用：(目的基因)(宿主細(xì)胞)DNA重組技術(shù)的基本工具(3)、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”2.作為載體必須具備的條件：①具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入，而且該切割位點(diǎn)必須位于載體本身必需的基因序列之外。，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。②能夠自我復(fù)制或整合到染色體DNA上后隨染色體DNA復(fù)制。③帶有標(biāo)記基因，便于篩選。

④本身是安全的，不能對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生危害。⑤大小適中，便于操作。DNA重組技術(shù)的基本工具(3)、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”3.載體的種類：

①質(zhì)粒：一種祼露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，能夠自我復(fù)制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子；②λ噬菌體的衍生物；③動(dòng)植物病毒。DNA重組技術(shù)的基本工具(3)、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”基因工程中最常用的載體——質(zhì)粒1．來源：質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、酵母菌等生物中。2．結(jié)構(gòu)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子，如圖所示：3．標(biāo)記基因：質(zhì)粒上有一些特殊的基因，如抗四環(huán)素基因、抗氨芐青霉素基因，用于對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定和選擇。

實(shí)際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。DNA重組技術(shù)的基本工具(3)、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”提醒:細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體的區(qū)別

細(xì)胞膜上的載體的化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物,也可能是生物，如動(dòng)植物病毒等?；瘜W(xué)本質(zhì)不同：功能不同：

細(xì)胞膜上的載體功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”,把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。

(1)一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些天然的載體進(jìn)行人工改造。

(2)限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須是在所需的標(biāo)記基因之外，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，有利于對(duì)目的基因的檢測(cè)。

(3)為使目的基因與載體形成相同的DNA片段末端以便連接，通常使用同一種限制酶將二者切割，為了得到互補(bǔ)的末端。只有互補(bǔ)關(guān)系的兩個(gè)末端才可連接。DNA重組技術(shù)的基本工具[關(guān)鍵一點(diǎn)]課堂總結(jié)基因工程的別名__________________操作環(huán)境操作對(duì)象____________操作水平__________________操作過程__________________實(shí)質(zhì)____________結(jié)果DNA重組技術(shù)/基因拼接技術(shù)基因DNA分子水平基因重組剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)1、基因工程：2、基因工程的基本工具：(1)“分子手術(shù)刀”——________(2)“分子縫合針”——________(3)“分子運(yùn)輸車”——________DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體限制性核酸內(nèi)切酶生物體外新的生物類型和生物產(chǎn)品3、與DNA分子相關(guān)酶的比較1、下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的是（）A、①②

B、①③

C、①④D、②③2、下列哪一種酶是基因工程的工具酶（）

A、DNA連接酶B、DNA酶

C、RNA酶D、運(yùn)載體課堂練習(xí)3、下列有關(guān)DNA連接酶的敘述正確的是()A．T4DNA連