質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則-編制說明

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》（送審稿）編制說明《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)起草組2019年7月1目錄（一）工作簡(jiǎn)況.............................................................................................................................41、任務(wù)來源...........................................................................................................................42、目的和意義.......................................................................................................................43、協(xié)作單位...........................................................................................................................44、標(biāo)準(zhǔn)編制過程和主要工作過程.......................................................................................45、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作...........................................................................6（二）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù).....................................................61、標(biāo)準(zhǔn)編制原則...................................................................................................................62、確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù).....................................................................................62.1外觀及性狀..............................................................................................................62.2質(zhì)粒超螺旋含量測(cè)定..............................................................................................62.2.1瓊脂糖凝膠電泳法........................................................................................62.2.2HPLC法...........................................................................................................72.3質(zhì)粒大小鑒定..........................................................................................................82.3.1試驗(yàn)方法.......................................................................................................82.3.2測(cè)定結(jié)果.......................................................................................................82.4質(zhì)粒序列鑒定..........................................................................................................92.4.1試驗(yàn)方法.......................................................................................................92.4.2測(cè)定結(jié)果.......................................................................................................92.5質(zhì)粒純度鑒定..........................................................................................................92.5.1內(nèi)毒素含量鑒定...........................................................................................92.5.2RNA污染鑒定..............................................................................................102.5.3基因組污染鑒定.........................................................................................122.5.4蛋白質(zhì)污染鑒定.........................................................................................132.5.5微生物污染鑒定.........................................................................................14（三）主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果...........141實(shí)驗(yàn)材料及儀器...............................................................................................................141.1試劑........................................................................................................................1421.2溶液 151.3儀器 152實(shí)驗(yàn)方法 162.1指標(biāo)的建立 162.2關(guān)鍵指標(biāo)的測(cè)定 16質(zhì)粒抽提方法及流程 16、質(zhì)粒測(cè)定 194.方法驗(yàn)證 245、經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益 24（四）采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度， 以及與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國(guó)外樣品、樣機(jī)的有關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比情況 25（五）與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 25（六）重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 25（七）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建議 25（八）貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過渡辦法等內(nèi)容） 25（九）廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議 25（十）其他應(yīng)予說明的事項(xiàng) 253（一）工作簡(jiǎn)況1、任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國(guó)標(biāo)委公布的 2018年第 四 批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目（國(guó)標(biāo)委綜合號(hào)），本項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)為 20184475-T-469 ，名稱為 質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則 。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（ SAC/TC387）提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由 中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院生物研究所、 通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司等聯(lián)合起草。2、目的和意義腫瘤免疫療法給腫瘤的有效控制帶來了迅速的進(jìn)展，免疫療法也入選《科學(xué)》最值得關(guān)注的6大科學(xué)領(lǐng)域，其中CAR-T細(xì)胞療法所帶來的臨床收益是最值得肯定的。CAR-T療法（嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法），其基本原理是對(duì)人體的T細(xì)胞進(jìn)行基因識(shí)別和體外基因合成改造，使其擁有超強(qiáng)的識(shí)別力和殺傷力，然后在不傷害健康細(xì)胞的情況下，消滅腫瘤細(xì)胞。目前，諾華（Norvatis）以CD19為靶點(diǎn)的CAR-T療法藥物CTL019已經(jīng)獲得了美國(guó)FDA頒發(fā)的優(yōu)先評(píng)審資格、突破性療法認(rèn)定，治療兒童或年輕人中復(fù)發(fā)或難治性的急性B細(xì)胞型淋巴性白血病。在國(guó)內(nèi)，CAR-T的臨床試驗(yàn)領(lǐng)先的是中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院（301醫(yī)院），使得中國(guó)研發(fā)團(tuán)隊(duì)躋身于全球CAR-T細(xì)胞技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的前列。據(jù)粗略估算，該療法衍生的新藥開發(fā)領(lǐng)域的市場(chǎng)容量可以高達(dá)百億甚至千億美金的規(guī)模。在CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)和治療中，質(zhì)粒是必不可少的，如果不能規(guī)范質(zhì)粒抽提及測(cè)定，將會(huì)延緩CAR-T藥物開發(fā)速度，并造成非常大的資源浪費(fèi)。根據(jù)市場(chǎng)的要求，制定出符合 CAR-T療法的質(zhì)粒要求，為腫瘤治療的研發(fā)推廣保駕護(hù)航。目前全球范圍內(nèi)尚無針對(duì)這種技術(shù)的規(guī)范性文件，國(guó)內(nèi)該產(chǎn)業(yè)正處于起步階段，行業(yè)規(guī)范急需解決。3、協(xié)作單位4、標(biāo)準(zhǔn)編制過程和主要工作過程4.1項(xiàng)目預(yù)研（1）2018 年1月至 2018年3月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，課題組成員廣泛收集了國(guó)內(nèi)外 100余篇標(biāo)準(zhǔn)、文4獻(xiàn)，了解了國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動(dòng)態(tài)，并且明確了工作思路和進(jìn)程安排。（2）2018年9月標(biāo)準(zhǔn)起草單位向全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提交了項(xiàng)目建議書以及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)草案。（3）2018年9月，起草小組對(duì)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)匯報(bào)了《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)的起草工作，與會(huì)專家就《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)（草案）進(jìn)行了討論，提出了寶貴的意見和建議。標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)專家意見進(jìn)行了修改和完善。4.2項(xiàng)目立項(xiàng)研制（4）2019年1月收到全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)生檢標(biāo)〔2019〕1號(hào)文件《關(guān)于下達(dá)2018年第四批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》以及該標(biāo)委會(huì)轉(zhuǎn)發(fā)的國(guó)標(biāo)委發(fā)函〔2018〕83號(hào)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委關(guān)于下達(dá)2018年第四批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》立項(xiàng)文件，計(jì)劃編號(hào)：20184475-T-469。（5）2018年9月至2019年5月，進(jìn)行《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)的起草研制工作。完成了《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)的編制說明，并對(duì)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)匯報(bào)了《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)（草案）進(jìn)一步完善和修改情況，向全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提交了《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)（征求意見稿）和編制說明。4.3項(xiàng)目征求意見2019年7月4日，全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)就《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)向全體委員專家（44位專家）征求意見。共收集44位委員專家回函，其中收到10份有意見或建議的單位回函。起草小組已按照專家意見建議進(jìn)行修改完善。詳見“國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)反饋意見匯總表—《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿?！?019年7月8日，就《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)（征求意見稿）向行業(yè)相關(guān)專家征求意見。與會(huì)專家提出了寶貴意見建議，起草單位已按照專家的意見建議進(jìn)行修改完善。(8) 年 月至 月，標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)專家意見，對(duì)《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)（征求意見稿）進(jìn)行修改和完善，形成送審稿，報(bào)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)行審定。年月日至月日，全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)就《質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則》標(biāo)準(zhǔn)送審稿組織函審。本TC全體委員人數(shù)為 44人，參與投票44人，投票同意本標(biāo)準(zhǔn)通過審查 42人，達(dá)到3/4通過。全體委員中，有 人為起草組成員。5(10) 年 月 日至 月 日，標(biāo)準(zhǔn)起草組針對(duì)函審專家提出的意見建議進(jìn)行了匯總整理，主要是單位、格式等一般編輯性的建議，已按專家意見建議修改。有幾條技術(shù)性意見修改情況如下：1,統(tǒng)籌考慮目前抽提和檢測(cè)不同方法的共性并體現(xiàn)先進(jìn)性;2,需要增加質(zhì)粒的濃度和純度檢測(cè)，并有相應(yīng)的檢測(cè)方法和指標(biāo);3,質(zhì)粒純度檢測(cè)可采用精度更高，操作更為方便的方法，如HPLC;4,標(biāo)準(zhǔn)中不能出現(xiàn)適量、足夠、可能、少許等模棱兩可的詞匯，左右的描述都需要科學(xué)量化。(11) 年 月 日， 會(huì)后起草小組對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行了進(jìn)一步修改和完善。形成了報(bào)批稿。報(bào)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。5、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作（1）、本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：（二）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的起草是在對(duì)國(guó)內(nèi)外資料分析、 研究及整理的基礎(chǔ)上，并按照標(biāo)準(zhǔn)的制定及《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的程序與基本要求進(jìn)行。本編制說明按 GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》參照GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫與規(guī)則第四部分：化學(xué)分析方法》。2、確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)2.1外觀及性狀將樣品加水或TE稀釋的質(zhì)粒溶液，目測(cè)外觀應(yīng)為無色無味的透明溶液，溶液中不含固體顆粒及其他機(jī)械雜質(zhì)。2.2質(zhì)粒超螺旋含量測(cè)定瓊脂糖凝膠電泳法試驗(yàn)方法采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)質(zhì)粒的超螺旋形態(tài)進(jìn)行鑒定，是實(shí)際生產(chǎn)中最為普遍的6方法。通過觀察膠圖發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)樣質(zhì)粒帶，通常是2-3條（意即質(zhì)粒的三種形態(tài)，線性、開環(huán)、超螺旋），至上而下分別為線性（不經(jīng)常出現(xiàn)）、開環(huán)、超螺旋，通過比對(duì)這幾種質(zhì)粒條帶的亮度來判斷超螺旋的含量。具體試驗(yàn)方法參見（（三）（1））。如下圖實(shí)例所示：測(cè)定結(jié)果合格的質(zhì)粒要求超螺旋形態(tài)的含量 ≥80%法試驗(yàn)方法具體方法參見（（三）（5））。質(zhì)粒超螺旋含量計(jì)算方法（1）質(zhì)粒純度的計(jì)算（如下圖實(shí)例所示）：質(zhì)粒純度以PPi計(jì)，數(shù)值以（%）含量表示，按式（2）計(jì)算：PPi=Ai/At ×100????????????????（2）式中：PPi-------試樣質(zhì)粒純度；Ai--------試樣峰面積；At--------總峰面積。7測(cè)定結(jié)果要求通過計(jì)算，算得的超螺旋形態(tài)質(zhì)粒的峰面積比值≥ 80%2.3質(zhì)粒大小鑒定試驗(yàn)方法通常采用限制性酶切法對(duì)質(zhì)粒大小進(jìn)行鑒定，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳同時(shí)借助標(biāo)準(zhǔn)大小Marker，能夠準(zhǔn)確的判斷質(zhì)粒的大小。具體試驗(yàn)方法參見（（三）（4））。如下圖實(shí)例所示：測(cè)定結(jié)果合格的質(zhì)粒要求酶切結(jié)果中，酶切產(chǎn)物條帶，上帶要亮于下帶且所有條帶大小的加和等于質(zhì)粒的大小。另超螺旋的質(zhì)粒帶大小通常小于質(zhì)粒的實(shí)際大小。82.4質(zhì)粒序列鑒定試驗(yàn)方法Sanger測(cè)序法是準(zhǔn)確確認(rèn)質(zhì)粒每一個(gè)堿基通用方法，通過該方法，能夠?qū)|(zhì)粒中每一個(gè)A、G、C、T進(jìn)行精準(zhǔn)定位，甚至可以通過測(cè)全質(zhì)粒，精確知曉質(zhì)粒的大小到個(gè)位數(shù)。具體試驗(yàn)方法參見（（三）（3））。如下圖實(shí)例所示：測(cè)定結(jié)果將Sanger測(cè)序法得到的結(jié)果與相應(yīng)的軟件結(jié)合，判斷質(zhì)粒的實(shí)際序列與理論序列是否完全匹配。要求質(zhì)粒的實(shí)際測(cè)序結(jié)果須與理論序列完全匹配，且測(cè)序的峰圖中單個(gè)堿基的峰型要尖銳且唯一。2.5質(zhì)粒純度鑒定質(zhì)粒純度鑒定是質(zhì)粒在成功交付之前非常重要的質(zhì)量QC環(huán)節(jié)。質(zhì)粒純度鑒定通常包括如下幾個(gè)要素鑒定，分別是內(nèi)毒素含量、RNA污染、基因組污染、蛋白質(zhì)污染以及微生物污染鑒定5個(gè)方面。不管其中哪一個(gè)要素的不合格，都將對(duì)交付質(zhì)粒的后續(xù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響。內(nèi)毒素含量鑒定試驗(yàn)方法參見GB/T14233.2-93測(cè)定結(jié)果按不同試驗(yàn)要求，對(duì)內(nèi)毒素含量要求不一，通常分為以下三個(gè)等級(jí)：X＞50EU950EU≥X＞5EU5EU≥X＞0EU污染鑒定瓊脂糖凝膠電泳法試驗(yàn)方法具體方法參見（（三）（1））。測(cè)定結(jié)果通常要求質(zhì)粒中不能含有肉眼可見的 RNA污染條帶。 HPLC法試驗(yàn)方法具體方法參見（（三）（5））。含量計(jì)算RNA含量計(jì)算方法與質(zhì)粒超螺旋含量計(jì)算方法相同。測(cè)定結(jié)果測(cè)得的RNA含量要求應(yīng)小于1%。實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)RNA殘留試驗(yàn)方法具體方法參見（（三）（8））。繪制曲線（實(shí)例）通過5組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA的溶解曲線，可檢測(cè)出特異性的峰值，且無特異性擴(kuò)增的雜峰和引物二聚體的小峰，說明引物適合下面 qpcr實(shí)驗(yàn)。從擴(kuò)增曲線看出，當(dāng)質(zhì)粒DNA的濃度高時(shí)CT值大，且從左到右濃度減小 CT值增大。通過數(shù)值計(jì)算出標(biāo)10準(zhǔn)品的濃度與循環(huán)閾值（ CT值）得線性曲線表達(dá)式：Ct=-2.1578LogC＋15.271溶解曲線圖Real-timePCR擴(kuò)增曲線11qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果要求測(cè)得的RNA含量應(yīng)不高于10pg/ul。基因組污染鑒定瓊脂糖凝膠電泳法試驗(yàn)方法具體方法參見（（三）（1））。如下圖所示：測(cè)定結(jié)果要求點(diǎn)樣膠圖中，基因組條帶不可見實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)基因組殘留試驗(yàn)方法具體方法參見（（三）（8））。測(cè)定結(jié)果12測(cè)得的基因組殘留不應(yīng)高于 10pg/ul。蛋白質(zhì)污染鑒定紫外光譜法試驗(yàn)方法采用紫外光譜法主要用于測(cè)量質(zhì)粒濃度， 其中關(guān)于A260/280的比值通常用于初步判斷質(zhì)粒中蛋白質(zhì)的污染情況。同樣該方法也同樣可以檢測(cè)質(zhì)粒中 RNA的污染情況和鹽離子雜質(zhì)等的污染情況。具體方法參見（ （三）（2））。如下表實(shí)例所示：Sample#ng/ulA260A280A260/280A260/2301308.696.1743.2251.912.222291.035.8213.0761.892.183357.857.1573.7681.92.164349.966.9993.6651.912.185285.265.7053.0061.92.1962995.983.1751.882.127395.977.9194.0781.942.238293.755.8753.0681.912.239278.225.5642.9291.92.1810239.264.7852.5151.92.1411296.425.9283.0561.942.212328.686.5743.3961.942.213304.326.0863.1131.962.2214197.483.952.0211.952.215211.44.2282.1951.932.1916271.345.4272.7861.952.2217228.944.5792.3991.912.1818218.624.3722.2771.922.1819233.464.6692.3991.952.1820300.726.0143.1671.92.18測(cè)定結(jié)果測(cè)得的A260/280的比值要求在1.8-2.0之間，高于2.0則有RNA污染，低于1.8則13為蛋白質(zhì)污染。同樣A2608/230應(yīng)當(dāng)高于2.0，低于2.0則鹽離子雜質(zhì)等污染。法試驗(yàn)方法參見GB/T19495.8-2004測(cè)定結(jié)果測(cè)得結(jié)果蛋白質(zhì)污染應(yīng)不高于 0.1%。微生物污染鑒定試驗(yàn)方法參見GB4789.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)和GB4789.15-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果測(cè)得結(jié)果要求，在單位面積內(nèi)，大腸桿菌的數(shù)量不能超過 1個(gè)，霉菌和酵母的數(shù)量不能超過1個(gè)。（三）主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果實(shí)驗(yàn)材料及儀器1.1 試劑葡萄糖（glucose，C?H??O?）三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM，Tris,C4H11NO3)鹽酸（hydrochloricacid，HCI）4. 乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodium salt， Na2EDTA，C10H14N2Na2O8)核糖核酸酶A（RnaseA）氫氧化鈉（Sodiumhydroxide，NaOH）7. 十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecyls μ，lfateSDS，C12H25SO4Na）醋酸鉀（potassiumacetate，CH3COOK）冰醋酸（AceticAcid，CH3COOH）14鹽酸胍（GuanidineHydrochloride，Gu-HCI，CH6ClN3）乙醇（ethanol，C?H?O）異丙醇（Isopropanol，C3H8O）2ml離心管1.5ml離心管二氧化硅質(zhì)粒吸附柱RNaseA（10mg/ml）1.2 溶液溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，100μg/mlRnase溶液Ⅱ：200mMNaOH，1%SDS溶液Ⅲ（pH4.2）：4M鹽酸胍，0.5M醋酸鉀。BufferW1:20mMTris-Cl,5mmol/L鹽酸胍，15%異丙醇。BufferW2：20mMTris-Cl,75%乙醇。TE（pH8.0）：10mMTris-Cl，1mMEDTA。80%乙醇滅菌水1.3 儀器搖床（工作范圍15℃-42℃）渦旋混合儀水浴鍋（工作范圍20℃-90℃）高效液相色譜（HPLC）設(shè)備一代測(cè)序儀超微量分光光度計(jì)電泳儀凝膠成像系統(tǒng)3730型測(cè)序儀PCR儀離心機(jī)（可在4°C下進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速達(dá)12000r/min以上）15金屬浴實(shí)驗(yàn)方法2.1指標(biāo)的建立本標(biāo)準(zhǔn)的起草單位經(jīng)過反復(fù)討論，對(duì)能體現(xiàn)質(zhì)粒抽提及鑒定的技術(shù)參數(shù)及表征方法進(jìn)行了確定。質(zhì)粒是細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體（或擬核）以外的 DNA分子，存在于細(xì)胞質(zhì)中，具有自主復(fù)制能力，使其在子代細(xì)胞中也能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息，是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子。質(zhì)粒抽提是去除RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒。所以質(zhì)粒抽提及測(cè)定主要體現(xiàn)在質(zhì)粒純度（A260/280，殘余RNA，基因組DNA，內(nèi)毒素，細(xì)菌計(jì)數(shù)），構(gòu)型（超螺旋程度），正確性（限制性酶分析）。質(zhì)粒抽提方法統(tǒng)計(jì)如下:硅膠柱法磁珠法酚仿提取及異丙醇沉淀法離子交換法質(zhì)粒檢測(cè)方法統(tǒng)計(jì)如下：瓊脂糖凝膠電泳法紫外光譜法Sanger測(cè)序法限制性酶切法HPLC法樣品細(xì)菌檢測(cè)法BCA法實(shí)時(shí)熒光PCR法2.2 關(guān)鍵指標(biāo)的測(cè)定質(zhì)粒抽提方法及流程（1）硅膠柱法16收集2-4mL菌液到2ml離心管中，12000rpm/min，離心1min。②棄上清，盡可能干燥。③向離心管中加入250μl溶液Ⅰ（加入RNaseA），渦旋震蕩使得細(xì)胞重新懸?、芟螂x心管中加入250μl溶液Ⅱ（裂解Buffer），溫和翻轉(zhuǎn)離心管6-10次，使菌體充分裂解，液體變得澄清濃稠。向離心管中加入350μl溶液Ⅲ，溫和翻轉(zhuǎn)離心管6-10次，此時(shí)可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm室溫離心10min?⑥將離心后上清移至二氧化硅吸附柱中，12000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。吸附柱中加入500μlBufferW1，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。向吸附柱中加入600μlBufferW2（加入無水乙醇），12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液向吸附柱中再次加入600μlBufferW2（加入無水乙醇），12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液⑩將吸附柱和收集管放回離心機(jī)中，12000rpm空轉(zhuǎn)離心2min。將吸附柱移至新的1.5mLEP管中，向吸附柱中央的膜加40-50μl預(yù)熱滅菌水，靜置3-5min，12000rpm離心2min，洗脫得到液體質(zhì)粒DNA。（2）磁珠法收集2-4mL菌液到2ml離心管中，12000rpm/min，離心1min。棄上清，盡可能干燥。向離心管中加入250μ溶l液1（加入RNaseA），渦旋震蕩使得細(xì)胞重新懸浮。向離心管中加入250μ溶l液2，溫和翻轉(zhuǎn)離心管6-10次，使菌體充分裂解，液體變得澄清濃稠。向離心管中加入350μ溶l液3，溫和翻轉(zhuǎn)離心管6-10次，此時(shí)可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm室溫離心10min。上清加入新的1.5ml離心管，再加入15μl的磁珠懸浮液，震蕩混勻，放置5分鐘，（如需高產(chǎn)量，可放置10分鐘）期間混勻幾次。把離心管放到磁力架上，靜置30sec，磁珠自動(dòng)被吸附在管壁，吸棄上清，磁珠分離要在磁力架上完成。20 加入500μlBufferW2，顛倒混勻，放到磁力架上，靜置 30秒，吸棄上清，磁珠分17離要在磁力架上完成。21 再次加入500μlBufferW2，顛倒混勻，放到磁力架上，靜置 30秒，吸棄上清，磁珠分離要在磁力架上完成。室溫放置5分鐘，確保乙醇揮發(fā)干凈，加50μl洗脫液，輕輕吹打使磁珠完全懸浮于洗脫液后，于室溫靜置1分鐘。把離心管放到磁力架上，靜置30sec，磁珠自動(dòng)被吸附在管壁，將洗脫液轉(zhuǎn)移到潔凈的離心管中，-20℃中保存?zhèn)溆?。?）酚仿提取及異丙醇沉淀法收集2-4mL菌液到2ml離心管中，12000rpm/min，離心1min。棄上清，盡可能干燥。向離心管中加入250μ溶l液1（加入RNaseA），渦旋震蕩使得細(xì)胞重新懸浮。向離心管中加入250μ溶l液2，溫和翻轉(zhuǎn)離心管6-10次，使菌體充分裂解，液體變得澄清濃稠。向離心管中加入350μ溶l液3，溫和翻轉(zhuǎn)離心管6-10次，此時(shí)可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm室溫離心10min。取上清中于新的EP管中，并記錄體積。加等體積的苯酚/氯仿溶液，振蕩充分混勻，12000rpm離心10min。上清液中于新的EP管中。小心吸取上清液中于新的EP管中，再次加等體積的苯酚/氯仿溶液，振蕩充分混勻，12000rpm離心10min。小心吸取上清液中于新的EP管中，加等體積的異丙醇混勻，12000rpm離心10min。小心棄去上清。加入1ml75%乙醇清洗沉淀，12000rpm1min，棄去上清。36 于超凈工作臺(tái)開風(fēng)將殘留乙醇吹干，加 50-100μlddH2O溶解，-20℃保存。（4）離子交換法從轉(zhuǎn)染的細(xì)菌平板中挑取中等大小，飽滿，而且沒有和其他克隆接觸的單克隆，接種到4ml選擇性培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)6小時(shí),220rpm。取上一步菌液接種到300ml選擇性培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)16小時(shí),220rpm。把300ml的菌液倒進(jìn)500ml離心杯中，4℃離心，6000g離心10分鐘。倒掉上清，并倒扣在吸水紙上片刻．然后加入30ml4℃預(yù)冷的細(xì)胞重懸液bufferP118（確定是否加了 RNase）,反復(fù)吹打沉淀至沒有懸浮的菌塊。加入30ml細(xì)胞裂解液bufferP2，徹底而且輕柔地顛倒混勻4-6次，在室溫下孵育不要超過5分鐘（從開始加P2時(shí)計(jì)時(shí)，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使質(zhì)粒DNA斷裂）。加入30ml預(yù)冷的bufferP3,及時(shí)地而且輕柔（避免局部十二烷基磺酸鉀沉淀）地顛倒混勻4-6次，在冰上孵育10分鐘。后再一次混勻樣品．8000g，4℃離心20分鐘在層析柱的頂端加濾紙，并且用bufferQBT潤(rùn)濕。用20ml的bufferQBT來平衡層析柱，讓液體自由的流下（盡量將潤(rùn)濕面積減到最?。?。然后把上一步的上清小心移到層析柱中（不可將沉淀繞動(dòng)），讓液體自由流下。用20mlbufferQC清洗層析柱一次.用20mlbufferQF洗脫DNA,用50ml的離心管分別收集洗脫液。在洗脫液中各加入0.7倍體積的室溫的異丙醇沉淀DNA。49 離心前一定要上下顛倒混勻，然后在 4℃,8000g離心20分鐘。取出時(shí)保持管平行移動(dòng)，小心的倒去上清.注意:不要將沉淀倒掉.用2ml室溫的70％乙醇清洗沉淀(清洗沉淀鹽及置換異丙醇),4℃,8000g離心10分鐘。取出時(shí)保持管平行移動(dòng)，小心倒掉上清.注意:不要將沉淀倒掉。在空氣中干燥沉淀5-10分鐘,用合適體積的TE（一般500μl）溶解沉淀。、質(zhì)粒測(cè)定1）瓊脂糖凝膠電泳法稱取需要量的瓊脂糖于燒瓶中，取適量的電泳緩沖液加入燒瓶，在微波爐中融化瓊脂糖，旋轉(zhuǎn)使之均勻混合。②待瓊脂糖冷卻至55℃時(shí)，加入熒光染料溴化乙啶，倒入插有樣孔梳的凝膠灌制平板上，去除氣泡。③待瓊脂糖凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)陰極。④在電泳槽中加入足量的電泳緩沖液，蓋住凝膠并超過膠高1mm。⑤將所制備的質(zhì)粒樣品加上加樣緩沖液（LoadingBuffer）后混勻，總量不能超過凝膠孔的容積，并加入適量的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物Marker。⑥連接導(dǎo)線，使質(zhì)粒在凝膠中由陰極向陽極移動(dòng)，設(shè)定電壓強(qiáng)度，一般是191V/cm~5V/cm，開始電泳。⑦ 當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)染料遷移的距離足以判斷質(zhì)粒片段的分離時(shí)， 關(guān)閉電源，電泳結(jié)束。⑧ 將電泳結(jié)束的凝膠直接置于紫外燈下進(jìn)行觀察并拍照，并根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行初步分析。2）紫外光譜法打開核酸微量定量?jī)x。② 打開電腦桌面軟件，從主菜單界面選擇核酸樣品檢測(cè)模塊 NucleicAcid。③ 在測(cè)量前，要選擇樣品種類，即選擇 dsDNA。④ 抬起測(cè)量平臺(tái)上臂，用移液器吸取 2μl純水滴于測(cè)量平臺(tái)中央，輕放測(cè)量平臺(tái)上臂，點(diǎn)擊空白對(duì)照按鈕 Blank。⑤用干凈的吸水紙擦去上下測(cè)量平臺(tái)上殘留的純水，吸取2μl待測(cè)樣品滴于測(cè)量平臺(tái)中央，輕放測(cè)量平臺(tái)上臂，點(diǎn)擊樣品測(cè)量按鈕Measure，約1-2sec后，計(jì)算機(jī)便會(huì)計(jì)算并顯示出樣品測(cè)量的各種參數(shù)，讀取ng/μl所顯示的數(shù)值。⑥ 定量完成后，選擇 Exit退出，關(guān)閉微量定量?jī)x電源。⑦ 核酸微量定量?jī)x會(huì)顯示質(zhì)粒的濃度， A260/A280，A260/A230的比值，A260/A280為1.8-1.9，A260/A2302.0的質(zhì)粒DNA樣品可視為較純DNA。（3）Sanger測(cè)序法①取0.2ml的PCR管，編號(hào)，將管插到冰上，按下表配制體系。試劑體積（μl）BigDyeMix1待測(cè)質(zhì)粒1測(cè)序引物1滅菌水2②反應(yīng)總體積為5μl，蓋緊PCR管后，瞬離。③將PCR反應(yīng)管置于PCR儀上擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)置如下：溫度 循環(huán)數(shù)98°C2min 196°C10s ，50°C5s ，60°C4min 254°C -20④ 將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的 1.5mlEP管中。⑤ 加入 25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分混勻，置冰上 10min，沉淀 DNA。4°C,12000r/min離心5min,小心棄上清。⑥ 加入50μ75%l（v/v）洗滌沉淀2次。4°C，12000r/min離心5min，棄去上清，真空干燥10min.⑦ 加入12μl去離子甲酰胺，混勻，充分溶解 DNA，瞬離。⑧ 將溶液轉(zhuǎn)移至新的 EP管中，瞬離。98°C變性5min，迅速插入冰上，靜置2min。⑩上機(jī)。11數(shù)據(jù)處理（4）限制性酶切法①取0.2mlEP管，編號(hào)。按下表體系添加試劑體積（μl）質(zhì)粒(100ng/μl)210×限制性酶buffer1限制性酶10.5限制性酶20.5滅菌水6總反應(yīng)體積10μl。② 混勻，蓋緊蓋子，瞬離，置于預(yù)先設(shè)定好溫度的水浴鍋中，反應(yīng) 10-30min。③ 取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)方法參考附錄 B.1瓊脂糖凝膠電泳法④ 判斷質(zhì)粒經(jīng)酶切后的電泳條帶是否符合理論大小。5）HPLC液體質(zhì)粒為待測(cè)樣液。② 將疏水層析柱Source15PHEcolumn連接到HPLC系統(tǒng)，檢測(cè)波長(zhǎng) 260nm。柱溫為室溫，流速1ml/min。③ 用1.5M硫酸銨、10mMTris–Cl（pH8.0）的溶液平衡層析柱。④ 供試樣液和平衡溶液按照 1:10混勻，作為上樣液。21⑤取30μl稀釋后的供試樣液進(jìn)樣，并使用平衡液繼續(xù)洗脫0.8min。⑥改用10mMTris–Cl（pH8.0）的溶液繼續(xù)洗脫0.7min。⑦重新使用1.5M硫酸銨、10mMTris–Cl（pH8.0）的溶液洗脫5.5min。⑧收集吸光度和電導(dǎo)率數(shù)據(jù)。⑨計(jì)算質(zhì)粒所占峰面積所占比例來計(jì)算質(zhì)粒純度。（6）樣品細(xì)菌檢測(cè)法參考GB4789.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)GB4789.15-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)7）BCA法參考GB/T19495.8-2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 蛋白質(zhì)檢測(cè)方法8）實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)基因組gDNA殘留分別配置濃度為1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1ng/μl、10ng/μl的大腸桿菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品。② 按如下體系配置 qPCR反應(yīng)體系，大腸桿菌基因組 DNA標(biāo)準(zhǔn)品也按照同樣方法配置反應(yīng)體系和進(jìn)行 qPCR反應(yīng)。質(zhì)粒DNA(10ng)1μl上游引物0.5μl(100-1000nmol/L)下游引物0.5μl(100-1000nmol/L)TaqDNA聚合酶0.5μlPCR反應(yīng)buffer1μlDNTP0.2mMSYBRGreen核酸染料0.5μlddH2O5μl③ 按如下反應(yīng)條件進(jìn)行 qPCR反應(yīng)預(yù)變性 94°C10min循環(huán)反應(yīng) 94°C15s60°C 45s溶解曲線 95°C 15s60°C 60s95°C 15s22④根據(jù)1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、1ng/μl、10ng/μl的大腸桿菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)粒DNA中的基因組DNA殘留量。9）實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)大腸桿菌質(zhì)粒中RNA殘留準(zhǔn)備大腸桿菌細(xì)胞用于RNA提取。② 將大腸桿菌細(xì)胞吸入 EP管中，12000r/min離心1min，棄上清，加入 1mLTrizol混勻，室溫裂解