免疫組化總結(jié)

免疫組化總結(jié)1、酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)1） 標(biāo)本固定：固定的目的是①方止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin's液或mDF液效果較好。2） 脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。3） 脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60度20min,然后立即二甲苯1-3分別10min（這個(gè)時(shí)間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當(dāng)天制好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。4） 抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實(shí)驗(yàn)室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯(cuò)。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要你覺(jué)得修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。5） 細(xì)胞通透：目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（＞10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用TritonX-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑，一般在PBS中加入后終濃度是0.05%即可，而前者終濃度是0.5%-1%。石蠟切片4um左右可以不通透，因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)被切開(kāi)了。6） 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般10?30min；用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。不過(guò)，現(xiàn)在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。7） 血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過(guò)度8） 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h,而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在4度最佳，反應(yīng)溫和，但時(shí)間最好超過(guò)16?24h。9） 抗體稀釋液:其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，我一直用國(guó)產(chǎn)的專用抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒(méi)有結(jié)合），最后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。10） 切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；③沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見(jiàn)特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）11） DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。12） 復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。13） 封片：為了長(zhǎng)期保存，我們一般用中性樹(shù)膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。2、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1） 冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。2） 組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min,尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。3） 血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來(lái)源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min。4） 一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h,而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。5） 二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。6） 復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。7） 封片：為了長(zhǎng)期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。8） 切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見(jiàn)特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）9） 拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；檢查時(shí)間每次以1~2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過(guò)2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí),須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開(kāi)啟15-30分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4°C保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無(wú)明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無(wú)熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。3、免疫組化和免疫熒光結(jié)果分析：見(jiàn)第一場(chǎng)試驗(yàn)講座。案例一DAB染色后切片著色一片黃/背景深背景:奧運(yùn)會(huì)期間我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，許多從北京購(gòu)買的試劑買不到，對(duì)我們的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的SP三步法染色試劑盒，效果不錯(cuò)，在奧運(yùn)會(huì)期間我準(zhǔn)備做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn)，第一批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好，抗體濃度感覺(jué)比較合適（SantaCruz公司1：200）,等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，我又從福州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒，同時(shí)抗體稀釋液也不夠了，我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難辨別。問(wèn)題及其解答：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？1、 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。2、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3、 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；4?非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；5、 DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；7、 標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。我的實(shí)際解決方案：1、 首先排除抗體孵育條件。一般來(lái)說(shuō)，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò)，因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先排除。2、 其次，DAB孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)？做出來(lái)那一次我是孵育8min,后來(lái)也是8-10min,我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來(lái)排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時(shí)先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。3、 最后，血清封閉的問(wèn)題？以前我一般孵育15-30min，所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h,其它條件同做出來(lái)的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。4、 此外，我在改進(jìn)的同時(shí)，也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)，甚至完全參照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作（我以前一般一抗4度過(guò)夜且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、SP反應(yīng)37度30min），以及過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與第一次做出來(lái)相比，只有兩個(gè)地方做了改動(dòng)：因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。5、 我用PBS替代一抗稀釋液（我以前還回收抗體，自我覺(jué)得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑），其它步驟和組織切片完全與第一次做出來(lái)的一致（包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)），奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好。--因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，結(jié)果是前者偏酸性（＜6、0），而后兩者均在7、5左右。6、 看來(lái)主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問(wèn)題了，于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，結(jié)果還是沒(méi)有做出來(lái)：背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎？通過(guò)仔細(xì)分析：一抗一定是結(jié)合上去了（老SP試劑盒結(jié)果很好），問(wèn)題是二抗沒(méi)有結(jié)合上去也不對(duì)（因?yàn)樽詈蟊尘昂苌睿@說(shuō)明二抗可能也結(jié)合上去了），DAB孵育時(shí)間現(xiàn)在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。7、 我做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，其余試劑（二抗、SP）均用新試劑盒提供的，結(jié)果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來(lái)封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字?。結(jié)果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導(dǎo)致了我的免疫組化結(jié)果的不佳，望大家在以后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注意這兩個(gè)不太引人注意的關(guān)鍵問(wèn)題。-慘痛的教訓(xùn)，值得引以為鑒。案例二DAB染色后切片著色呈陰性結(jié)果背景：其實(shí)免疫組化在DAB染色后一般有四種情況：陽(yáng)性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽(yáng)臉（染色不均勻）。而陰性染色是許多初學(xué)者經(jīng)常遇到的頭疼問(wèn)題。我身邊有個(gè)研究生同學(xué)在我們實(shí)驗(yàn)室初次涉入免疫組化，聽(tīng)說(shuō)步驟不難，跟我后面做了幾次之后，就自己開(kāi)始做了，連續(xù)做了三次，結(jié)果均是陰性染色。很掃興，不知是什么原因?qū)е碌?。?wèn)題及其解答：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？1、 抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液，怎么這么高稀釋度也沒(méi)能做出陽(yáng)性結(jié)果？另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。2、 抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。3、 組織切片本身這種抗原含量低；4、 血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。5、 DAB孵育時(shí)間過(guò)短。6、 細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。7、開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。我的實(shí)際解決方案:1、 首先，排除組織切片內(nèi)的抗原有無(wú)丟失及其含量多少。免疫組化中兩個(gè)最重要的因素是抗原和抗體。（1）抗原有無(wú)丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過(guò)3-6個(gè)月，可能切片內(nèi)的抗原丟失很嚴(yán)重（有文獻(xiàn)支持），此時(shí)可以通過(guò)重新用石蠟塊切片來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證（蠟塊需要低溫保存）。（2）石蠟切片在制作過(guò)程中可能因醛基對(duì)抗原決定族的封閉，這需要通過(guò)抗原修復(fù)來(lái)充分暴露，從而增加抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，提高陽(yáng)性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù)，用枸櫞酸鈉緩沖液。（3）組織切片中本身抗原含量的多少？這方面我有教訓(xùn)的，我做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞鑒定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)，幾乎呈陰性，后來(lái)證實(shí)是因?yàn)閮烧呖乖肯嗖钌踹h(yuǎn)，則一抗也要適當(dāng)提高濃度。2、 其次，檢查抗體有無(wú)選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件是否不適。（1）一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果，因?yàn)殪`敏度低但特異性好；一抗的speciesreactivity中無(wú)檢測(cè)組織的種屬，這是比較常見(jiàn)的錯(cuò)誤；一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。（2）抗體孵育時(shí)間過(guò)短，容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議4度孵育過(guò)夜和37度復(fù)溫45min；二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說(shuō)明書(shū)。（3）抗體濃度過(guò)低。這是陰性結(jié)果的最可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說(shuō)明書(shū)建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度（工作液就好辦了，直接滴加），重點(diǎn)摸索一抗的最適濃度。注意：免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng)，這提示不是濃度越高，陽(yáng)性率就越高，反之亦然。（4）重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質(zhì)量：原裝抗體一般比較穩(wěn)定，效果較好；而進(jìn)口分裝次之；工作液可能要注意質(zhì)量問(wèn)題。3、 同時(shí)，DAB的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長(zhǎng)，在鏡下觀察，有時(shí)可延長(zhǎng)至30min。但一般3-10min最好，此時(shí)背景也較淺。否則，說(shuō)明抗體濃度不合適。4、 最后，血清封閉時(shí)間也可相應(yīng)縮短。一般10-30min，但這個(gè)時(shí)間可以調(diào)整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。5、 此外，細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透，因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已經(jīng)把細(xì)胞切開(kāi)了，但對(duì)于胞核蛋白，建議還是通透一下，促進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)。6、 以上原因，都是針對(duì)實(shí)際中常見(jiàn)原因來(lái)進(jìn)行分析的，前提是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰性結(jié)果，這就需要新手還是要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以排除方法的問(wèn)題。還有抗體稀釋液的PH值過(guò)低等其它原因的干擾?？傊氚衙庖呓M化做好，可能每一個(gè)環(huán)節(jié)都很重要，但也存在主次之分，出現(xiàn)問(wèn)題了，需要通過(guò)先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對(duì)免疫組化原理掌握與否的關(guān)鍵所在。案例三石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果背景：因?qū)嶒?yàn)需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1（一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白）免疫熒光染色，以前我對(duì)酶免疫組化非常熟悉，在園子內(nèi)也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一直還沒(méi)做過(guò)（原理知道，但細(xì)節(jié)不太了解）。我先用石蠟切片做了5次，結(jié)果一直不理想（表現(xiàn)為未見(jiàn)特異性強(qiáng)染色）；近幾日，我又切了冰凍切片，做了2次，終于基