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文檔簡介
綜合性實驗三
血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳1.掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義;2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的操作技術(shù);3.熟悉電泳儀器的使用和操作。一、實驗?zāi)康模憾?、實驗原理:(一)電?electrophoresis):帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極方向泳動的現(xiàn)象。正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。1.球形帶電顆粒在電場作用下所受的力電場力F=XQ
(X-電場強(qiáng)度,Q-粒子所帶電荷)阻力F'=6πrηv
(r-粒半徑,η-介質(zhì)粘度,v-粒運(yùn)動速度)當(dāng)F=F',(電泳達(dá)平衡),XQ=6πrηv移項得v/X=Q/6πrη遷移率
(mobility):U=v/X=Q/6πηrv/X,
單位電場強(qiáng)度時粒子運(yùn)動的速度帶電粒子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì):即與其所帶電量成正比;與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。移動速度:v=d/t(cm/秒)電場強(qiáng)度:X=E/l(伏特/cm)(單位距離內(nèi)電勢差)d/tE/ldlEt2.兩種不同物質(zhì)的電泳分離遷移率U=v/X=——=——
(單位:cm2·伏特-1·秒-1)物質(zhì)(A)在電場中移動的距離為dA=UA
·
Et/l物質(zhì)(B)在電場中移動的距離為dB=UB
·
Et/l兩物質(zhì)移動距離的差為Δd=dA-dB=(UA
–
UB)·
Et/l物質(zhì)A和B能否分離取決于兩者遷移率。如兩者的U相同,則不能分離;如有差別則能分離。兩物質(zhì)的分離距離:與電壓和電泳時間成正比,與電場的距離成反比。小結(jié):帶電粒子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì):即與其所帶電量成正比;與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。兩物質(zhì)的分離距離:與電壓和電泳時間成正比,與電場的距離成反比。電泳法:利用在電場的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的方法和技術(shù)。(二)影響電泳速度的因素⒈樣品本身帶電量:Q
越多,v越大。分子大?。簉越小,v越大。形狀:球形分子>纖維狀分子。⒉電場強(qiáng)度:X
越大,v越大。d=U·Et/l
U=v/X=Q/6πηrV=d/t=U·E/l
=U·X
=Q·E/(6πηr·l)⒊緩沖液成分:性質(zhì)穩(wěn)定,不易電解。pH:pH-pI越大,Q越多,v越大。離子強(qiáng)度:0.02~0.2M。I越大,樣品電流減小,v變??;I越小,樣品電流越大,v越大,但樣品易擴(kuò)散。⒋支持介質(zhì):惰性材料,有一定堅韌度,易保存;吸附力要小;無電滲作用。電滲:液體對固體的相對移動,由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間所產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起。電滲與電泳方向相同,v
變大;反之變小。簡言之,在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲(electro-osmosis)。原因:固體支持物多孔,帶可解離化學(xué)基團(tuán),常吸附溶液中正離子或負(fù)離子,使溶液相對帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時,紙上纖維素吸附OH-帶負(fù)電荷;而與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+帶正電荷。因此,若樣品質(zhì)點在電場中移向負(fù)極,結(jié)果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快,若質(zhì)點是移向正極,則表現(xiàn)速度比其固有速度要慢,可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。甚至,當(dāng)電滲作用大于電泳時,樣品質(zhì)點可“不進(jìn)反退”,向電泳相反方向移動。附:電滲⒌溫度:過高,產(chǎn)熱增加、水分蒸發(fā),對電泳不利。產(chǎn)生熱量(Q=I2Rt)對電泳技術(shù)不利,因產(chǎn)熱可促使支持介質(zhì)上溶劑蒸發(fā),而影響緩沖溶液離子強(qiáng)度。溫度升高,介質(zhì)粘度下降,分子運(yùn)動加劇,自由擴(kuò)散變快,遷移增加。為降低熱效應(yīng)對電泳影響,可控制電壓或電流,也可安裝冷卻散熱裝置。對高壓電泳增設(shè)冷卻系統(tǒng),防樣品變性?!鲇绊戨娪具w移率的因素:FrictionCharge外加電流、電壓分子量分子形狀分子的等電點VoltageCATHODEANODE+--+FrictionCharge在確定的條件下,某物質(zhì)的遷移率為常數(shù),是該物質(zhì)的化學(xué)特征常數(shù)醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點在pH4.0~7.3之間,在pH8.6的緩沖溶液中均帶負(fù)電荷,在電場中向正極泳動。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同,所以帶電荷量也不同。此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異,因此在同一電場中泳動的速度不同。分子小而帶電荷多者,泳動較快;反之,則較慢。(三)血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理+白蛋白(A)α1α2
βγ定量----將染色后的區(qū)帶分別剪開,將其溶與堿液,進(jìn)行比色測定,計算各區(qū)帶的百分?jǐn)?shù)。醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)(厚約120m),滲透性強(qiáng),對分子移動的阻力很弱。用其作支持物進(jìn)行電泳,具有微量、快速、簡便、分離清晰、對樣品無吸附現(xiàn)象等優(yōu)點?,F(xiàn)已廣泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。三、實驗器材1.電泳儀:為電泳提供直流電源。2.電泳槽:為電泳提供場所。多用有機(jī)玻璃制成,電極用鉑絲。3.血清加樣器:可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜:2cm×8cm5.其它:培養(yǎng)皿(直徑9-10cm)、濾紙、玻璃板、鑷子等。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽
四、實驗試劑和材料1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH=8.6,離子強(qiáng)度0.075):稱取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥鈉,置于大燒杯中,加蒸餾水約600ml,稍加熱溶解,冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml。置4℃保存,備用。2、染色液:稱取0.5g氨基黑,甲醇50ml,冰醋酸10ml,蒸餾水加至100ml。3、漂洗液:取無水乙醇45ml,冰乙酸5ml和蒸餾水50ml,混勻置塞試劑瓶內(nèi)貯存。3、0.4N氫氧化鈉:稱取氫氧化鈉16.0g,蒸餾水加至1000ml1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇
將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中5-10分鐘后。
每組取醋酸纖維素薄膜1張,取時用鑷子夾住薄膜一端,風(fēng)干或置于試管上,晾干,注意區(qū)分薄膜的“光面”和“毛面”。
五、實驗操作步驟(一)儀器與薄膜的準(zhǔn)備
2.電泳槽的準(zhǔn)備
點樣時,先在醋酸纖維薄膜的無光澤面距一端1.5cm處,預(yù)先用鉛筆劃一條線作為點樣線,在緩沖液中浸泡10分鐘后,晾干,去除多余的緩沖液(防止樣品擴(kuò)散稀釋),用點樣器的邊緣沾上血清后,在點樣線上迅速地壓一下,使血清通過點樣器印吸在薄膜上,點樣力求均勻。(見圖)。此步是實驗的關(guān)鍵。醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖(虛線處為點樣位置)(二)點樣
(先劃線,再浸泡)
將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下),另一端平貼在陽極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直,中間不能下垂。
連接好電泳儀。在室溫下電泳,打開電源開關(guān),調(diào)節(jié)電壓為100伏,電泳時間1hr。電泳后,調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零,關(guān)閉電泳儀切斷電源。醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板(三)電泳
電泳完畢后將薄膜取下,用剪刀剪出個性小口(標(biāo)記用),直接浸于氨基黑10B的染色液中,染2min取出。將薄膜從染色液中取出后用水沖洗后,依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗,最后再用清水漂洗一遍,直至可清晰分辨出5條色帶。風(fēng)干或晾干。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖(四)染色與漂洗
漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進(jìn)行描述、記錄在實驗報告本上,并判斷分析其結(jié)果。
注意事項:
薄膜和鉛筆畫示意圖均要提供,需要標(biāo)示每條染色后條帶的名稱,并討論說明判斷原因。
(五)記錄和分析實驗結(jié)果六、注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點樣時,應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去,
吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時,動作要輕、穩(wěn),用力不能太大,以免損壞
膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上,點樣量要適量,不宜過
多或過少。5、電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳槽的負(fù)極端,且
點樣面向下(為什么?)。6、應(yīng)控制染色時間。時間長,薄膜底色不易脫去;時間
太短,著色不易區(qū)分,或造成條帶染色不均勻,必要
時可進(jìn)行復(fù)染。臨床意義
血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分,含量為60~80g/L,絕大部分由肝臟合成,僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成,正常值:白蛋白57%—72%α1球蛋白2%—5%α2球蛋白4%—9%β球蛋白6.5%—12%γ球蛋白12%—20%
血漿蛋白的主要功能:
維持血漿膠體滲透壓
調(diào)節(jié)血漿p
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