生化實(shí)驗(yàn)(七)-綜合性實(shí)驗(yàn)之三-血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 2013

綜合性實(shí)驗(yàn)三

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳1.掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義;2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的操作技術(shù);3.熟悉電泳儀器的使用和操作。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾?、?shí)驗(yàn)原理：（一）電泳(electrophoresis)：帶電粒子在電場(chǎng)中向與其電性相反的電極方向泳動(dòng)的現(xiàn)象。正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。1.球形帶電顆粒在電場(chǎng)作用下所受的力電場(chǎng)力F=XQ

(X－電場(chǎng)強(qiáng)度，Q－粒子所帶電荷)阻力F'=6πrηv

(r－粒半徑，η－介質(zhì)粘度，v－粒運(yùn)動(dòng)速度)當(dāng)F=F'，(電泳達(dá)平衡)，XQ=6πrηv移項(xiàng)得v/X=Q/6πrη遷移率

(mobility):U=v/X=Q/6πηrv/X,

單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度帶電粒子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)：即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。移動(dòng)速度:v=d/t(cm/秒)電場(chǎng)強(qiáng)度:X=E/l(伏特/cm)(單位距離內(nèi)電勢(shì)差)d/tE/ldlEt2.兩種不同物質(zhì)的電泳分離遷移率U=v/X=——=——

(單位:cm2·伏特-1·秒-1)物質(zhì)(A)在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為dA=UA

·

Et/l物質(zhì)(B)在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為dB=UB

·

Et/l兩物質(zhì)移動(dòng)距離的差為Δd=dA-dB=(UA

–

UB)·

Et/l物質(zhì)A和B能否分離取決于兩者遷移率。如兩者的U相同，則不能分離；如有差別則能分離。兩物質(zhì)的分離距離：與電壓和電泳時(shí)間成正比，與電場(chǎng)的距離成反比。小結(jié)：帶電粒子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)：即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。兩物質(zhì)的分離距離：與電壓和電泳時(shí)間成正比，與電場(chǎng)的距離成反比。電泳法：利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的方法和技術(shù)。（二）影響電泳速度的因素⒈樣品本身帶電量：Q

越多，v越大。分子大?。簉越小，v越大。形狀：球形分子>纖維狀分子。⒉電場(chǎng)強(qiáng)度：X

越大，v越大。d=U·Et/l

U=v/X=Q/6πηrV=d/t=U·E/l

=U·X

=Q·E/(6πηr·l)⒊緩沖液成分：性質(zhì)穩(wěn)定，不易電解。pH：pH-pI越大，Q越多，v越大。離子強(qiáng)度：0.02～0.2M。I越大，樣品電流減小，v變??；I越小，樣品電流越大，v越大，但樣品易擴(kuò)散。⒋支持介質(zhì)：惰性材料，有一定堅(jiān)韌度，易保存；吸附力要小；無(wú)電滲作用。電滲：液體對(duì)固體的相對(duì)移動(dòng)，由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間所產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起。電滲與電泳方向相同，v

變大；反之變小。簡(jiǎn)言之，在電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱(chēng)為電滲（electro-osmosis）。原因：固體支持物多孔，帶可解離化學(xué)基團(tuán)，常吸附溶液中正離子或負(fù)離子，使溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時(shí)，紙上纖維素吸附OH-帶負(fù)電荷；而與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+帶正電荷。因此，若樣品質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點(diǎn)是移向正極，則表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見(jiàn)應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。甚至，當(dāng)電滲作用大于電泳時(shí)，樣品質(zhì)點(diǎn)可“不進(jìn)反退”，向電泳相反方向移動(dòng)。附：電滲⒌溫度：過(guò)高，產(chǎn)熱增加、水分蒸發(fā)，對(duì)電泳不利。產(chǎn)生熱量(Q=I2Rt)對(duì)電泳技術(shù)不利，因產(chǎn)熱可促使支持介質(zhì)上溶劑蒸發(fā)，而影響緩沖溶液離子強(qiáng)度。溫度升高，介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)加劇，自由擴(kuò)散變快，遷移增加。為降低熱效應(yīng)對(duì)電泳影響，可控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。對(duì)高壓電泳增設(shè)冷卻系統(tǒng)，防樣品變性?！鲇绊戨娪具w移率的因素：FrictionCharge外加電流、電壓分子量分子形狀分子的等電點(diǎn)VoltageCATHODEANODE+--+FrictionCharge在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的化學(xué)特征常數(shù)醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH4.0～7.3之間，在pH8.6的緩沖溶液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所以帶電荷量也不同。此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異，因此在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度不同。分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)較快；反之，則較慢。（三）血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理+白蛋白(A)α1α2

βγ定量----將染色后的區(qū)帶分別剪開(kāi)，將其溶與堿液，進(jìn)行比色測(cè)定，計(jì)算各區(qū)帶的百分?jǐn)?shù)。醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)（厚約120m），滲透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)的阻力很弱。用其作支持物進(jìn)行電泳，具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分離清晰、對(duì)樣品無(wú)吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)已廣泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。三、實(shí)驗(yàn)器材1.電泳儀：為電泳提供直流電源。2.電泳槽：為電泳提供場(chǎng)所。多用有機(jī)玻璃制成，電極用鉑絲。3.血清加樣器：可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜：2cm×8cm5.其它：培養(yǎng)皿（直徑9-10cm）、濾紙、玻璃板、鑷子等。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽

四、實(shí)驗(yàn)試劑和材料1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH=8.6，離子強(qiáng)度0.075)：稱(chēng)取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥鈉,置于大燒杯中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml。置4℃保存，備用。2、染色液：稱(chēng)取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水加至100ml。3、漂洗液：取無(wú)水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml，混勻置塞試劑瓶?jī)?nèi)貯存。3、0.4N氫氧化鈉：稱(chēng)取氫氧化鈉16.0g，蒸餾水加至1000ml1.醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇

將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中5-10分鐘后。

每組取醋酸纖維素薄膜1張，取時(shí)用鑷子夾住薄膜一端，風(fēng)干或置于試管上，晾干，注意區(qū)分薄膜的“光面”和“毛面”。

五、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備

2.電泳槽的準(zhǔn)備

點(diǎn)樣時(shí)，先在醋酸纖維薄膜的無(wú)光澤面距一端1.5cm處，預(yù)先用鉛筆劃一條線作為點(diǎn)樣線，在緩沖液中浸泡10分鐘后，晾干，去除多余的緩沖液(防止樣品擴(kuò)散稀釋)，用點(diǎn)樣器的邊緣沾上血清后，在點(diǎn)樣線上迅速地壓一下，使血清通過(guò)點(diǎn)樣器印吸在薄膜上，點(diǎn)樣力求均勻。（見(jiàn)圖）。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）（二）點(diǎn)樣

(先劃線，再浸泡)

將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上(見(jiàn)下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。

連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓為100伏，電泳時(shí)間1hr。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板（三）電泳

電泳完畢后將薄膜取下,用剪刀剪出個(gè)性小口（標(biāo)記用），直接浸于氨基黑10B的染色液中，染2min取出。將薄膜從染色液中取出后用水沖洗后，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出5條色帶。風(fēng)干或晾干。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖（四）染色與漂洗

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告本上，并判斷分析其結(jié)果。

注意事項(xiàng)：

薄膜和鉛筆畫(huà)示意圖均要提供，需要標(biāo)示每條染色后條帶的名稱(chēng)，并討論說(shuō)明判斷原因。

（五）記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、注意事項(xiàng)1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，

吸水量以不干不濕為宜。3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞

膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過(guò)

多或過(guò)少。5、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且

點(diǎn)樣面向下（為什么？）。6、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間

太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要

時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。臨床意義

血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分,含量為60～80g/L,絕大部分由肝臟合成,僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成,正常值:白蛋白57%—72%α1球蛋白2%—5%α2球蛋白4%—9%β球蛋白6.5%—12%γ球蛋白12%—20%

血漿蛋白的主要功能:

維持血漿膠體滲透壓

調(diào)節(jié)血漿p