第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

生物化學(xué)與分子生物學(xué)張金玉常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。目前這種技術(shù)已廣泛用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。常用的固相支持物硝酸纖維素膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜。轉(zhuǎn)膜的方法1、毛細(xì)管虹吸法：利用高鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用和虹吸作用。雖轉(zhuǎn)移率不高，但應(yīng)用廣泛。2、電轉(zhuǎn)印法：利用電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到膜上。適用于轉(zhuǎn)移大片段DNA。3、真空轉(zhuǎn)移：原理同毛細(xì)管虹吸，需真空泵。用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)探針的種類人工合成的寡核苷酸片段、基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段。探針的標(biāo)記物1、核素標(biāo)記物：（放射性同位素）靈敏度高，特異性強(qiáng)，常用32P，35S，3H，125I，14C。易造成放射性污染，同位素半衰期短，必須隨用隨標(biāo)。2、非核素標(biāo)記物：靈敏度低，特異性差，但無放射性污染，探針標(biāo)記后可長(zhǎng)期保存（2年以上）。常用生物素、地高辛、辣根過氧化物酶（HRP）、熒光素（FITC、羅丹明類）、化學(xué)發(fā)光劑。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。（一）DNA印跡

(Southernblotting)1、制備待測(cè)DNA，DNA的限制性內(nèi)切酶消化；2、待測(cè)DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分離；3、凝膠中核酸的原位變性；4、轉(zhuǎn)膜；5、雜交；6、洗膜；7、雜交結(jié)果的檢測(cè)-放射自顯影。用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。ＤＮＡ印跡①②③放射自顯影照片SouthernblottingSouthernblotting（二）RNA印跡(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析其技術(shù)原理與Southernblotting相同。RNA分子較小，轉(zhuǎn)移前無需限制酶切割；在變性劑存在下（防止形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后，不需要再進(jìn)行變性和中和，直接轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移效率也比較高。盡管RNA印跡技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平的敏感性較PCR法低，但其特異性強(qiáng)，假陽(yáng)性率低，仍然被認(rèn)為是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究1、混合蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；2、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或其他膜上（電轉(zhuǎn)移）；3、第一抗體首先與轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子結(jié)合；4、第二抗體（放射性核素或堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記）與之結(jié)合；5、放射自顯影或底物顯色來檢測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號(hào)。三種印跡技術(shù)的比較斑點(diǎn)印跡(dotblotting)不經(jīng)電泳分離直接將樣品點(diǎn)在ＮＣ膜上用于雜交分析原位雜交(insituhybridization)

組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析DNA芯片技術(shù)(DNAchip)

將多種已知序列的ＤＮＡ排列在一定大小的尼龍膜或其他支持物上用于檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中的核酸種類。其他：DNA芯片技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnologyPCR（polymerasechainreaction)中文全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。PCR技術(shù)是1985年由美國(guó)Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。

PCR具有敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。

KaryMullis本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。一、PCR技術(shù)的工作原理

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。

以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5'末端和3'末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。PCR的基本反應(yīng)步驟1.變性(Denaturation)：

加熱到94℃使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，同時(shí)引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以消除。2.退火(復(fù)性)(Annealling):

將溫度下降至適宜溫度（較Tm低5℃-55℃

），模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。PCR的基本反應(yīng)步驟3.延伸(Extension):將反應(yīng)溫度升至酶的最適溫度72℃

，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，以引物的3'端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。

上述3步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性94?C延伸72?C退火55?C5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55目錄PCR技術(shù)的工作原理Cycle355

555

5

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5

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555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄PCR技術(shù)原理示意圖

PCR擴(kuò)增的特異性是由一對(duì)寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來的DNA擔(dān)負(fù)起始模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5'端之間的DNA片段。

模板DNA

PCR技術(shù)對(duì)模板質(zhì)和量的要求并不十分嚴(yán)格。一般來說宜用ng量的克隆DNA，μg水平的染色體DNA作起始材料。

特異性引物預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

耐熱DNA聚合酶（耐熱TaqDNA聚合酶）

dNTPs

Mg2+

緩沖液水

PCR反應(yīng)體系的基本組成成分利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因的體外突變將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性。（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)RT-PCR示意圖原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了mRNA和miRNA水平的快速、準(zhǔn)確的定量分析，已經(jīng)在基因診斷方面得到臨床應(yīng)用。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理實(shí)時(shí)PCR的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分子，并使熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量成正比，對(duì)每一反應(yīng)時(shí)刻的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，即可計(jì)算出PCR產(chǎn)物量。也稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR或熒光定量PCR。實(shí)時(shí)PCR分類實(shí)時(shí)PCR非探針類：加入了能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，

SYBRGreen-DNA小溝，熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合雙鏈DNA量成正比，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物量的多少-大量應(yīng)用探針類1.TaqMan探針法2.分子信標(biāo)探針法3.熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針法1、TaqMan探針法5’-熒光報(bào)告基團(tuán)-R3’-熒光淬滅基團(tuán)-QTaqMan探針：TaqMan探針能與模板DNA特異性結(jié)合。沒有擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，探針保持完整，R和Q同時(shí)存在于探針上，無熒光信號(hào)釋放；隨著PCR進(jìn)行，聚合酶在鏈上延伸遇到熒光探針，其5’→3’核酸外切酶活性將探針逐步切斷，R與Q分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)，被熒光檢測(cè)系統(tǒng)接收，用于數(shù)據(jù)分析。TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標(biāo)記引物RQ3'3'5'5'TaqMan探針法實(shí)時(shí)PCR原理示意圖2、分子信標(biāo)探針法與TaqMan探針法相似，也標(biāo)記有R和Q基團(tuán)，但不同的是分子信標(biāo)探針是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)寡核苷酸探針，即其兩端的核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)。探針未與靶序列雜交時(shí)形成發(fā)夾狀態(tài)R與Q靠近，熒光幾乎完全淬滅；雜交后，發(fā)夾展開，R與Q分開，熒光得以恢復(fù)，熒光檢測(cè)系統(tǒng)即可接收到熒光信號(hào)。3、FRET探針法：雙雜交探針或LightCycle探針

有兩條能與模板互補(bǔ)、且相鄰的特異探針組成（1～5bp），上游探針的3’端標(biāo)記熒光供體基團(tuán)，下游探針的5’端標(biāo)記Red640熒光受體基團(tuán)。復(fù)性時(shí)，兩探針同時(shí)結(jié)合在模板上，供體基團(tuán)和受體基團(tuán)緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生熒光能量被受體基團(tuán)吸收（發(fā)生FRET），可檢測(cè)到Red640發(fā)出的熒光；變性時(shí)，兩探針游離，兩熒光基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能檢測(cè)到Red640的熒光。

FRET探針法探測(cè)的是實(shí)時(shí)信號(hào)，是可逆的，在突變分析、SNP基因分型等方面更具有優(yōu)勢(shì)。第三節(jié)基因文庫(kù)GeneLibrary基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)基因文庫(kù)(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體?；蚪MDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選分離純化細(xì)胞基因組DNA；限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，獲得一定大小的DNA片段（20Kb左右）；選擇載體（噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等）；將基因組DNA片段連接入載體；將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴(kuò)增；用探針進(jìn)行雜交，篩選陽(yáng)性克隆，獲得目的基因?；蚪MDNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫(kù)

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選提純組織細(xì)胞mRNA；mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；選擇載體（質(zhì)?；蚴删w）；將cDNA連接入載體；將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴(kuò)增；用探針進(jìn)行雜交，篩選陽(yáng)性克隆，獲得目的基因。基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

cDNA文庫(kù)特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫(kù)具有組織或細(xì)胞特異性。

cDNA文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對(duì)

真核細(xì)胞來說，從基因組DNA文庫(kù)獲得的基因與從

cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。

cDNA文庫(kù)在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，從而使它在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是研究工作中最常使用到的基因文庫(kù)。第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique一、基因芯片基因芯片(genechip)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)?；蛐酒稍谕粫r(shí)間內(nèi)分析大量的基因，實(shí)現(xiàn)了基因信息的大規(guī)模檢測(cè)?；蛐酒貏e適用于分析不同組織細(xì)胞或同一細(xì)胞不同狀態(tài)下的基因差異表達(dá)情況。一、基因芯片基因芯片(genechip)

基因芯片的原理：雙色熒光探針雜交將兩個(gè)不同來源樣品的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)用不同的熒光分子（正常用紅色，腫瘤用綠色）進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的cDNA等量混合后與基因芯片進(jìn)行雜交，在兩組不同的激發(fā)光下檢測(cè)，獲得兩個(gè)不同樣品在芯片上的全部雜交信號(hào)。綠色熒光-該基因只在腫瘤組織表達(dá)；紅色熒光-正常組織表達(dá)；黃色-兩種組織均表達(dá)。雙色熒光標(biāo)記探針基因芯片工作流程示意圖二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)：抗原-抗體或受體-配體最常用的探針蛋白是抗體。蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。樣品標(biāo)記法蛋白質(zhì)芯片工作流程示意圖第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

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